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人胰岛因子1基因启动子的克隆及活性鉴定 路康 金蕊 周国平 南京医科大学第一附属医院儿科 X 关注成功！ 加关注后您将方便地在 我的关注中得到本文献的被引频次变化的通知！ 新浪微博 腾讯微博 人人网 开心网 豆瓣网 网易微博 摘????要： 目的:克隆含人胰岛因子1 (islet1, ISL1) 基因上游启动子序列的质粒并检测其在人胚肾HEK-293细胞中的启动子活性。方法:以HEK-293细胞提取的DNA为模板, PCR扩增ISL1基因启动子区全长1 419 bp片段;酶切后将此片段连接至pGL3-Basic载体, 克隆含有ISL1基因启动子片段的重组质粒;以此重组质粒为模板重复上述步骤构建一系列ISL1启动子5侧翼区截短质粒。将含ISL1启动子序列的重组质粒及其截短质粒转染至人胚肾HEK-293细胞, 双荧光素酶报告基因检测各片段的启动子活性, 找出启动子最小活性区域, 并通过生物信息学方法分析转录因子结合位点。结果:经酶切、测序鉴定, 成功构建含有ISL1启动子序列的重组质粒及其截短质粒。与p GL3-Basic空载体相比, 含有ISL1启动子序列的重组质粒启动子活性明显增加 (P0.01) 。ISL1最小活性区域位于转录起始位点-173 bp至-1 bp之间, 其中包含OCT-1、MYOD、E2F2等多个转录因子结合位点。结论:人ISL1转录起始点上游1 215 bp区域在HEK-293细胞中具有较强启动子活性。 关键词： 启动子活性; 胰岛因子1; 人胚肾细胞; 作者简介：周国平:通讯作者, E-mail:guopzhou@126.com 收稿日期：2017-06-17 Received： 2017-06-17 先天性心脏病是新生儿最常见的先天性疾病, 其主要病因是胎儿期心脏及大血管的发育出现了异常[1]。心脏作为胚胎发育中最为重要的器官, 其分化发育是一个极为复杂的过程, 牵涉许多基因的先后表达以及相互作用。而各种不同心脏组织可能是由心脏多种祖细胞分化形成, 胰岛因子1 (islet1, ISL1) 作为心脏祖细胞的标志分子之一, 其表达有着精确的时空调控机制, ISL1心脏祖细胞主要参与心脏第二生心区的分化发育, 成熟心脏中的众多细胞如内皮细胞、心肌细胞和起搏细胞均可由其分化发育而来[2-3]。现普遍认为ISL1是位于心脏分化发育复杂的基因调控网络的起始部分, 动物实验已经证实ISL1可与GATA4转录因子共同作用于下游靶基因来影响小鼠心脏分化发育[4], 而ISL1基因突变纯合子小鼠大约在胚胎发育的第10-11天间因严重的心脏发育缺陷而死亡[5], 由此可见ISL1对于心脏的分化发育至关重要。许多基因的表达都是通过各种转录因子与启动子序列的结合进行调控[6], 目前对于ISL1基因的启动子区域的转录调控机制还不是很清楚, 故本实验构建人ISL1基因启动子重组质粒, 进一步探讨ISL1基因的转录调控, 为了解先天性心脏病的发病机制提供新视角。 1 材料与方法 1.1 材料 p GL3-B基本载体 (p GL3-Basic) 和HEK-293细胞均本实验室保存;基因组DNA提取试剂盒、感受态大肠埃希菌 (北京天根公司) ;进口高糖细胞培养基、限制性内切酶KpnⅠ和BglⅡ、T4DNA连接酶 (Thermo Fisher公司) ;进口胎牛血清 (Scien Cell公司) ;普通DNA聚合酶以及DNA高保真酶 (Ta KaRa公司) ;5000和2000 DNA标准参照物 (北京擎科公司) ;质粒提取试剂盒以及胶回收试剂盒 (Omega公司) ;质粒转染试剂盒 (Invitrogen公司) ;单管发光仪 (Turner Biosystems公司) ;双荧光素酶报告检测试剂盒 (Promega公司) 。 1.2 细胞培养 HEK-293细胞采用常规方法培养, 用10 m L进口胎牛血清和1 m L青霉素-链霉素溶液 (青霉素含量为10 k U/m L, 链霉素含量为10 mg/m L) 加入至90 m L进口高糖培养基中作为细胞培养基, 将HEK-293细胞置于37℃、5%CO2的培养箱中培养。 1.3 重组报告质粒的构建与鉴定 以Ensembl中ISL1-001序列为模板, 用Primer5.0设计引物, 上下游引物5端分别加入限制性内切酶KpnⅠ、BglⅡ的酶切位点及保护位点, 共用下游引物为5-GGAAGATCTGCTGTGGCTAAGTGGG-AAA-3, 上游引物分别为P1 (p GL-1215/+204) :5-CGGGGTACCCCGTAACAGATGATGGGAACA-3;P2 (p GL-870/+204) :5-CGGGGTACCATCATTTCG-CTCTTTGGC-3;