pEGFP-C2-NLRC5重组质粒的构建及其表达.pdfVIP

安徽医科大学学报摇 Acta Universitatis MedicinalisAnhui摇 2014 Jan;49(1) ·5 · pEGFP鄄C2鄄NLRC5重组质粒的构建及其表达 徐摇 涛,彭云云,李摇 琳,黄摇 成,张摇 磊,金摇 涌,吕雄文,李摇 俊 摘要摇 目的摇 构建含NLRC5蛋白功能区的cDNA序列的真 [3] 节。 Cui et al 发现 NLRC5 负向调节 NF鄄资B 途径 核表达载体 pEGFP鄄C2鄄NLRC5,并检测其在肾成纤维细胞 以及 玉型干扰素(type鄄玉interferon,IFN鄄玉)型信号 (COS鄄7)中的表达。 方法摇 采用RT鄄PCR法从人肝星状细胞 发生途径,NLRC5 通过与I资B激酶琢(Ikappa B ki鄄 (LX鄄2) 中获得 NLRC5 蛋白功能区的cDNA 序列片段,用 nase alpha,IKK琢)以及 IKK茁 相互结合反应阻止了 EcoR 玉和BamH 玉双切酶将片段和载体pEGFP鄄C2 双酶切 它们的磷酸化过程,从而抑制了NF鄄资B途径,它也 后,酶切产物加入T4 连接酶16 益连接过夜,构建真核表达 能够通过与 RIG鄄1 以及 MDA5 相互反应抑制介于 载体pEGFP鄄C2鄄NLRC5。将构建成功的pEGFP鄄C2鄄NLRC5重 RLR 的IFN鄄I 型信号产生途径。 所以NLRC5 具有 组质粒经PCR,限制性内切酶酶切和测序鉴定后用阳离子脂 TM 有效抑制机体的天然免疫和炎症反应的功能。 NL鄄 质体Lipofectamine 2000将其转染至COS鄄7 细胞,荧光显微 镜下观察绿色荧光蛋白表达,Western blot 法鉴定融合蛋白 RC5 可能为未来提高微生物感染和免疫炎症相关 表达。 结果摇 阳性克隆经双酶切法鉴定可见NLRC5基因片 疾病的免疫力提供了一个有效的治疗靶标[4]。 该 段。 转染重组质粒后可观察到绿色荧光蛋白的表达,而且主 研究拟在pEGFP鄄C2 的多克隆位点插入NLRC5 cD鄄 要分布在细胞质中,Western blot法也可检测到在74 ku处有 NA,构建能够融合表达绿色荧光蛋白与NLRC5 蛋 一明显条带,其大小符合EGFP鄄NLRC5 表达的蛋白(NLRC5 白的重组质粒,为进一步研究NLRC5蛋白的免疫学 蛋白大小约为47 ku,EGFP蛋白大小约为27 ku),表明融合 功能提供了依据。 蛋白可在哺乳动物细胞中成功表达。 结论摇 成功构建pEG鄄 FP鄄C2鄄NLRC5质粒,NLRC5 蛋白可在 COS鄄7 细胞中成功表 1摇 材料与方法 达。 1.1摇 材料 关键词摇 NLRC5;COS鄄7;基因表达;重组质粒;转染 1.1.1摇 细胞系摇 真核表达重组质粒 pEGFP鄄C2 和 中图分类号摇 R349郾64 肾成纤维细胞 (COS鄄7)来自本实验室;DH5琢感受 文献标志码 A 文章编号 1000-1492(2014)01-0005-04 态细胞为本实验室保存。 摇 摇 天然免疫系统中的核苷酸结合寡聚结构域样受 1.1.2摇 主要试剂摇 胰蛋白酶、高糖 DMEM液体培 体NOD样受体(NOD鄄like receptor,NLR)家族成员 养基、胎牛血清 (美国Gibco 公司);BamH 玉、EcoR 之一———NLR家族含CARD结构域5(NOD