辣椒抗青枯病转基因育种研究.pdfVIP

全里夔薹望焦童苎兰垄塑堡室一一一一—— 辣椒抗青枯病转基因育种研究 李颖t李乃坚1余小林2王得元1袁四清1王恒明1 2．浙江大学细胞分子生物学实验室杭州310029) fl广东省农科院蔬菜所广州510640 摘要：本研究利用抗菌肽对细菌有强杀灭的特性，将抗茵肽基囡导入辣椒。通过常规接菌方法连续世代筛选，获 得抗青枯病能力接近或达到高抗辣椒资源的转基因辣椒株系。结合多代田间农艺性状的评价，选出优良株系进行配组， 日前已获得综合性状优良的转基因辣椒新组合。结果表明，转基因辣椒后代的外源基因仍能稳定且强烈地表达，经过严 格选育可获得符合育种要求的新材料。 关键词：辣椒；抗青枯病：转基因；一代组合 辣椒近年来在华南各省种植面积一直较大，辣椒生产已成为华南地区特色农业、三高农业的重要组 成部分，已成为许多市、县的支柱产业之一。但由于年年连作，且有些地区水分控制得不合理，使得辣 椒生产病害发生严重，造成减产，甚至失收，严重影响生产者的收益，挫伤椒农的积极性。 青枯病是南方各省辣椒最主要的毁灭性细菌性病害，其病原菌为假单孢青枯菌(Pseudomonas solanacearum Cecropia)和柞蚕(Antheraea Smith)。抗菌肽B和抗菌肽D是分别从天蚕(Hylophoa pemyi) 血淋巴中诱导出的一类杀菌活性多肽，对假单孢青枯菌有强杀伤力。我所于20世纪90年代末开始进行 了辣椒抗青枯病转基因育种的研究工作，目前已将抗菌肽B和D基因构建于同一质粒PCDB．U中，用 “三亲法”转化根癌农杆菌(BA4404)采用农杆菌介导技术将抗菌肽B、D基因导入辣椒且培育出转 基因植株，通过多代转基因植株的抗性鉴定及田间农艺性状的筛选，选出优良株系进行配组，目前已选 育出综合经济性状优良的转基因辣椒新组合，且转基因母本通过深圳卫生防疫站检测，外源基因表达仍 较强烈。 1 转化载体的构建及转基因的检测 试验材料：1826294856 位点。经琼脂糖凝胶电泳检测和酶切鉴定证实己获得具有双价基因的重组子pCDB．II，并且抗菌肽B、 D基因的上游都带有CaMV35c启动子，下游都带有NOS报告基因。 通过转化，共获得1200多株Kan抗性的再生辣椒，随机选取70株，抽取其DNA进行点杂交检 测，结果有15株显现阳性印迹：将点杂交检测为阳性的15株转基因辣椒植株进行PCR检测，其中8 株呈阳性，在125bp区域有一条清晰的DNA谱带；进一步的Southern blotting分析，其中4株呈阳性。 173株。 2转基因辣椒T0代及后代抗青枯病鉴定 从PCR检测呈阳性的转基因辣椒苗中随机取50株，另取未转基因起始品种(48号)共10株作对 X 照。采用灌根法接种青枯菌(1107cfu／m1)，置于光照陪养箱内，结果显示，转基因植株不但发病率明 显降低，而且显现病情也大为减缓。 全国蔬菜遗传育种学术讨论会 表1 转基因辣椒(To代)抗青枯病接种调查 株数 接种后存活株数(株)和存活率(％) 材料 (株) lOd ％ 15d ％ 30d ％ 对照(CK) 10 6 60 2 20 2 20 转基因植株 50 48 98 45 90 24 49 用浸根法，用浓度为1亿／毫升的青枯菌液浸根lo分钟，以高抗品种“粤椒三号”和感病品种“农丰二 号”为抗病和感病对照，试验结果表明，获得了抗青枯病能力接近或达到高抗对照“粤椒三号”、农艺 性状及产量表现均保持原有受体品种特性的转基因株系(见表2)。 表2转抗菌肽基因辣椒T3代5个株系对抗病性鉴定