鸡白细胞介素18成熟蛋白全长基因的克隆与序列测定.pdfVIP

中国畜牧兽医学会家畜传染病学分舍成立20周年庆典暨第十次学术研讨会论文集 鸡白细胞介素18成熟蛋白全长基因的克隆与序列测定 胡敬东，崔治中，范伟兴，刘文强，赵宏坤 (山东农业大学，山东省畜禽疫病防制工程技术研究中·心，山东泰安，271018) 细胞毒作用等多种生物学功能。由于其氨基酸序列与已知的其它任何蛋白都不同，因此1996年被重新 命名为自细胞介素18(interleukin 的作用，预示着它具有潜在的临床应用前景，尽管在医学上已经成为研究热点，但在兽医学方面有关鸡 IL一18成熟蛋白的全长编码区基因，并进行了序列分析。现将结果报告如下。 1、材料与方法 1．1材料 1．1．1细胞系；MDCC—MSBl细胞由本实验室保存。 1．1．3工具酶与主要试剂：限制性内切酶、TaqDNA聚合酶、RT—PCR试剂盒、DNA 1．1．4引物设计与合成：根据Schneider等报道的ChIL一18cDNA基因序列，设计一对引物。为便于 克隆与表达，在引物的两端分别加入了EcoRI和Sall酶切位点。 引物由上海博亚生物技术有限公司合成。 1．2方法 1．2．1 5 RNAIsolation 离心5min，弃去上清，用DEPC水悬浮沉淀，最后参照Promega公司Total 使用说明提取细胞的总RNA。 PCR 1．2．2 ChIL一18cDNA的RT—PCR扩增：参照TaKaRa公司RNA PCRBuffer、RNaseFree 在反应体系中依次加入以下成分：MgCl2、10×RNA Mixture、RNase Inhibitor、OligodT—AdaptorPrimer、RNA溶液、Reverse 总体积为20l。混匀后室温放置10 中国畜牧兽医学会家畜传染病学分会成立20周年庆典暨第十次学术研讨会论文集 Buffer5 DNA聚合酶0．251，i0×PCR l，反转录 TaqTM酶使用说明组成，包括rTaq 1,2．5mMdNTP4 产物2l，25M的特异性上、下游引物各11及36．75l的灭菌超纯水，总反应体系为501。反应的 热循环参数为：95℃预变性5min；94℃30sec，52*(2 C延 伸10min。扩增结束后取5l在0．8％琼脂糖凝胶中进行初步电泳鉴定，观察结果。 1．2．3PCR产物的纯化与回收：将经过初步鉴定的剩余45IPCR产物全部电泳、纯化、回收，操作方 法按照UNIQ—10柱式DNA胶回收试剂盒的使用说明书进行。 1．2．4克隆：将回收产物与pMDl8一T载体进行连接反应，再将连接产物转化E．coliTGl感受态细 胞，在含有X—gal、IPTG、Amp的琼脂平板上培养12～16h，挑取白色菌落接种于含有Amp的LB 液体培养基中，37c摇菌培养过夜，用碱裂解法小量提取质粒。 观察结果，将鉴定为阳性的质粒克隆送上海生工公司测序。 2、结果 2．1鸡IL一18 RNA，然后利用RT—PCR方法扩增得到略大于500bp的目的片段。 致的片段。 2．3 Schneider等首次报告的鸡IL一18序列完全相同，大小为510bp(见图I)。 GCClWTGTAAGGATAAAACTATCA从CGATTCTTTCGAAACGTCAATAGCCAG A F C K D K T I K R F F R N V N S Q TTGCTTGTGGTTCGTCCAGAT竹AAACGTGGCAGCTmGAAGATGTAACAGATCAG L L V V R P D L N V A A F E D V T D O GAGGTGAAATCTGGCAGTGGAATGTACTTCGACATTCACTGT