静水压对有包膜病毒——犬瘟热病毒的作用.pdfVIP

静水压对有包膜病毒——犬瘟热病毒的作用 池元斌。 夏成柱。 王雪梅。 何洪斌。 王琅弟。 李金中。 1．吉林大学超硬材料国家重点实验室长春130023 2中国人民解放军军需大学军事瞢医研究所长春130000 摘要 犬疽热病毒(cDV)的组织培养半敷细胞感染量(TcI％)测量显示，在250MPa虬上的静水压处理可 使CDV完全失活。电子显微镜观察揭示，静水压处理后，CDV的形态发生明显变化，受压后病毒粒子表面都有 凸起产生。琼脂糖凝胶电辣分析结果表明．高达510MPa的静水压处理30分钟．也投能破坏CDV病毒的基因。 关键词 犬瘟热病毒静水压强希 I 引言 应用静水压灭活病毒是近年来高压科学和技术与生物学交叉渗透，在应用领域里新发展起来的一种 有效方法[1,21。在大多数情况下，有效的抗病毒接种要求给免疫系统提供完整的病毒粒子，与此同时，还 要求消除病毒的感染性。1GPa以下的静水压只能破坏氢键、范巷瓦尔斯链等弱健．对共价作用没有明显 影响。静水压作为病毒失活的方法，有可能同时满足消除病毒感染性又保持病毒粒子完整性两种要求。 基于上述考虑．我们利用高压力技术对有包膜犬瘟热病毒进行了研究．现将部分结果报告如下。 2材料和方法 2．1病毒 犬瘟热病毒小DKⅥ是中国人民解放军军需大学军事兽医研究所犬病中心由小熊猫中分离出来的 犬瘟热病毒在犬肾(DK)细胞上培养的第九代病毒。 2．2病毒CDV的增殖 犬肾细胞在培养瓶的瓶壁长满单层后按1％浓度接种小DK、_，置于37℃培养箱中培养，待细胞长 满单层后用含2％犊牛血清维持液换液一次，病变后将病毒培养物反复冻融三次再以3000转／分离心沉 淀10分钟，取上清液获得小DK V10培养物。 2．3病毒TCIDS0测定 将小DK V10病毒液在灭过菌的容器中作连续10倍稀释，总共稀释7个稀释度，在96孔馓量培养板 上，采用同步接毒法，吸取每一稀释度的病毒液0．1ml加入到已加有0．1rid刚消化的DK敏感细胞液的 孔中，每个稀释度接种4个孔，置于37C，5％cQ温箱内培养，逐日观察，直到能够看到引起病毒增殖的 病毒最高稀释度。采用改进的Reed—Mu∞ch法计算TCID∞。 2．4 CDV粒子的电子显微镶检测 6．8的2％磷钨酸为染液，采用悬滴法对未处理的小DKVIo粒子进行负染色后，在电子显微镜 以pH 下观测粒子的形态。 5l 2．5Ⅲr桉麓的检测 使用反转录一聚合酶链反应(RT—PcR)方法r”，首先提取小DKV10病毒的总RNA并将其反转录 合成cDNA．然后对其部分H基因进行PCR扩增。通过琼脂糖凝胶电泳法分析扩增的基因片段。 3结果 3．1小DKVI． 在不同压力处理后的TCIDso为研究不同压力对小DKV0感染力的影响，把病毒DK vlo培养物分别 理及处理后小DK Vlo的TC[D50的测定结果如表l，随着处理压力的提高，小DKVIo的TCIDso减小，感染 力下降，在250MPa及其以上压力处理．小DKVm的感染力完全丧失。 表1不同静水压处理30分钟后小DK vl·的TCIDso测定数值 3．2静水压处理后cDv病毒粒子的微观形态及核酸的变化 V10的表面形态发生了明显变化。受压后病毒粒 电镱观寨结果告诉我们，经静水压处理后，小DK 子表面都有凸起形成，压力越高。凸起越明显。这表明．静水高压处理对病毒蛋白衣壳有明显的影响．至 250MPa，小DKVlo病毒衣壳和囊膜产生显著的变化，致使病毒失活。然而．对未经压力处理及分别经 150MPa、250MPa、510MPa静水压处理30分钟的小DK V10病毒粒子的H基因进行RT—PCR扩增后， 用琼脂糖凝