绒山羊细菌人工染色体BAC文库构建条件的优化.pdfVIP

中国畜牧兽医 2009年第36卷第10期 生物技术 ·55· 绒山羊细菌人工染色体BAC文库构建条件的优化 刘志红1，李宁2，任立明2，胡晓湘2，郭英2，崔文涛3，尹俊1，张文广1，李金泉1 3．中国农业科学院北京畜牧兽医研究所，北京100193) 摘要：近年来，细菌人工染色体BAC文库成为应用最广泛的基因组文库之一，它以其容最大、遗传特性稳定、嵌合体少、插 入片段易回收、操作简便等不可比拟的优点而被广泛应用于基因组较大的真核生物基因组研究之中。作者就细菌人工染色 脉冲电泳鉴定其大小。结果表明，本试验采用的方法既可获得较大的插入片段又可获得较高的转化效率，是较好的用于构建 大基因组文库的方法。 关键词：细菌人工染色体；文库；构建条件 中图分类号：S827．2 文献标识码：A 文章编号：1671—7236(2009)10—0055-04 基因组文库是利用DNA重组技术将某种生物 T4 细胞的核DNA的全部或大部分片段随机连接到克 Ill pCClBAC(HindCloning 隆载体上，再转移至适当的宿主细胞中，通过细胞增 DHl0B购 Epicentre公司；感受态细胞ElectroMax 殖而形成的各个片段的无性繁殖系的总集，完整的 pm透析膜购自 自Invitrogen公司；孔径为0．025 基因组文库的构建使任何DNA片段的筛选和获得 Millipore公司。 成为可能(刘薇．2004)。它是进行分子克隆和基因 1．2 方法 组结构与功能研究的基础，也是遗传和分子生物学 1．2．1 高分子质量DNA的制备取40mL新鲜 研究的重要手段。随着细菌人工染色体BAC载体 羊血液，加入红细胞裂解液分离白细胞，将细胞密度 的迅速发展，及在构建基因组文库方面越来越广泛 调到5×107个细胞／mL，用琼脂糖包埋法制备 的应用，使得细菌人工染色体BAC文库的构建技术 已日渐成熟，但在BAC文库的构建过程中，各种条 定酶切时间，预试验做部分酶切梯度，酶浓度依次为 件选择的恰当与否，会直接影响到BAC文库的构建 0、1、3、5、10、15 DNA；根据部分酶切的结果， U／btg 速度和质量。作者对BAC文库构建的一些基本条 确定最佳酶量和时间，进行大规模酶切。 件进行了研究，初步探索了构建高效细菌人工染色 1．2．2大片段DNA的分离纯化大规模酶切后 体BAC文库的方法。 分别采用二次电泳法(原晓俐，2007)和一次三段电 1材料与方法 1．1 材料CHEF—DRⅢ脉冲场电泳系统(美国 kb PMLSER 即在第1次电泳后，根据Marker切下150～500 BIO-RAD)、GENEII电击仪(美国BIo