大白鼠热休克反应中HSP70的表达动态分析.pdfVIP

大白鼠热休克反应中HSP70的表达动态分析’ 吉爱玲 胡轶红 封青川 李效阳 卢爱玲 徐存拴 (河南师范大学生物系，新乡 453002) 摘 要 用聚丙烯酷胺凝胶电泳 (SDS)和免疫印迹 (Westernblot)等方法分析了大白鼠 八种器官的蛋白质图谱及肝脏在不同热休克和恢复条件下热休克蛋白70(HSP70)表达的动态，结 果表明:(1)不同器官的蛋白质图谱有很大差异;(2)肝细胞、脾细胞对热休克反应敏感，产生 的HSP70较多;(3)不同温度 (42C,44C和46C)热休克处理 (30分钟，恢复24小时)表明，在 46C热休克处理组，肝细胞合成的HSP70最多;(4)在46℃处理30分钟后的1^-120小时恢复时间 内，HSP70量的变化接近于正态分布. 关性词 大白鼠 聚丙烯酸胺凝胶电泳 免疫印迹 热休克 热休克蛋白70 1962年法国学者Ritossa发现T果蝇的热休克反应 (heatshockresponse.HSR)。热休克 反应是指生物受到各种应激因子 (物理、化学、生物、生理等)刺激时，细胞和生物体合成 一组热休克蛋白(heatshockproteinHSP)，从而保护细胞和生物体免受应激胁迫的损害，这 一系列细胞水平的代谢和功能变化，就是生物的热休克反应。它是生物在长期进化过程中保留 下来的自我保护机制。热休克反应对生物抗逆能力的建立起至关重要的作用。近年来，人们广 泛而深入地研究了诱导生物发生热休克反应的因素和条件、热休克基因的表达和调控、热休 克蛋白的种类、结构、性质和功能、热休克反应的机理和生物学意义、以及HSP在生物生长、 分化、胚胎发育、生理功能和肿瘤发生中的作用等 (Ananthanetal.，1986;Pelhan,1986), 目前，国外采用细胞培养的方法对HSP的形成机理及功能的研究已相当深入 (Xuetal， 1997)，但对整体动物热休克反应的研究尚较少 (陈育庆等，1990)。对整体动物进行热休克反 应的研究，更具有实用价值和意义。本文系统地探讨了大白鼠在不同热休克条件下HSP70的 表达动态。现将结果报道如下: 1材料和方法 1.1 材 料 1.1.1实验动物 成年SD纯系大白鼠，由河南师范大学生物系实验动物房提供，雌雄各半， 体重200^-250g, 1.1.2 化学药品及试剂 丙烯酞胺 (USB)、甲叉双丙烯酞胺 (Fluka)、过硫酸按 (Bio- Rad)、四甲基乙二胺 (Bio-Rad),SDS (Gibco),Tris-base(Gibco),硝酸纤维素膜 (Gibco),标准分子量蛋白 (上海东风生物技术有限公司)、Tween20(Fluka)、考马斯亮蓝 R250(Fluka进口分装)、HSP70的一级抗体 (StressGen，产品编号SPA-820，为鼠源性单克 中法先进技术项目 (No.B96.11) 823 隆抗体，其制备抗原是人HSP70/HSC70，但亦能与人、灵长目动物、兔、大鼠、牛HSP70/ HSC70的N端1-180氨基酸区域特异结合)、二级抗体 (华美生物工程公司产品，为山羊抗鼠 IgG-AP)，本实验所用的化学试剂至少为分析纯。 1.2 方 法 1.2.1样品制备 将大白鼠随机分组，每组5只，置于电热鼓风干燥箱内((CS101-2D型，工 作室550mmX450mmX550mm，重庆四达实验仪器厂制造)于早上7:00-11:00按下述方式 进行热休克处理:(1)不同温度热休克处理组:420C,44℃和46℃分别处理动物30分钟，室 温 (25C)恢复24小时后取材;(2)46C热休克后不同恢复组:46℃处理动物30分钟、室温 (25C)分别恢复1,2.5,4,8,12,24,48,72,96,120小时后取材，取材时，摘除眼球 放血，脊椎脱臼处死，取各器官，在4`C,40mmol/LNaCI,20mmol/LTris-HCIpH7.5的 缓冲液中匀浆，12000g离心10分钟，取上清，分装，-85℃保存备用。 1.2.2 蛋白质浓度测定 按Neuhoff(1987)方法，测其吸光值后，在标准曲线上查得其蛋 白质浓度。 1.2.3 聚丙烯酞胺凝胶电泳 按Laemmli(1970)方法进行. 1.2.4Westernblot分析 按Towbin等(1