沉默β-连环素基因对肝癌细胞株SMMC-7721凋亡相关因子的影响.docVIP

精品论文 参考文献 沉默β-连环素基因对肝癌细胞株SMMC-7721凋亡相关因子的影响 汪丽燕1 李滨(通讯作者)2 薄晓通2 　　(1哈尔滨医科大学附属第四医院 黑龙江 哈尔滨 150001) 　　(2桂林医学院附属医院消化内科 广西 桂林 541001) 　　【摘要】 目的：探讨siRNA沉默beta;-连环素基因对肝癌细胞株SMMC-7721细胞凋亡的影响。方法：将SMMC-7721细胞分3组: 阴性对照组(n组)、转染试剂对照组(hd组)及重组质粒组(test组)。其中后者为应用RNA干涉技术设计构建了针对beta;-连环素mRNA的siRNA重组质粒，通过脂质体转染导入肝癌细胞株SMMC-7721中。用流式细胞技术检测细胞凋亡，半定量RT-PCR检测SMMC-7721细胞caspase-3、bcl-2、survivin mRNA表达。结果：针对beta;-连环素的siRNA转染肝癌细胞株SMMC-7721后，细胞凋亡率较对照组比明显增加(Plt;0.05)，caspase-3的mRNA的表达随时间并无明显变化，与对照组比无明显差异(Pgt;0.05);而p-caspase-3的mRNA的表达于48h后明显增加，72h表达量减少，96 h减少至原有水平。bcl-2、survivin mRNA的表达在转染beta;-连环素的siRNA 48h后明显减少，96h后恢复至原有水平。结论：沉默beta;-连环素基因可以一定程度上抑制肝癌细胞的生长，促进其凋亡。 　　【关键词】 肝癌; RNA干扰; beta;-连环素;细胞凋亡 　　【中图分类号】R73 【文献标识码】A 【文章编号】2095-1752（2015）26-0156-02 　　引言 　　研究发现Wnt基因与组织内环境稳定和肿瘤发生有关[1]， Wnt信号转导的关键，胞浆中存在的可溶性的beta;-连环素是Wnt信号的调节开关[2]。以beta;-连环素为中心的Wnt信号转导通路是肿瘤发生过程中关键的信号通路之一[3]。本研究通过沉默肝癌细胞株SMMC-7721中的beta;-连环素基因，揭示肝癌细胞中beta;-连环素对细胞凋亡的影响，证实Wnt/beta;-连环素信号传导通路在肝癌发生、发展中的作用及siRNA在肝癌基因治疗方面的作用，为研究肝癌发病机制的网络结构提供理论依据，同时也为肝癌的治疗提供方法及理论依据。 　　1.材料与方法 　　1.1 材料 　　基因扩增仪：肝癌细胞株SMMC-7721：购自于中科院上海细胞所；筛选有效的beta;-连环素-siRNA重组质粒序列：由上海吉玛制药技术有限公司建立与保存；DMEM及小牛血清为：G ibco产品；限制性内切酶BamH.及H ind oacute;、Tr izol及RT-PCR相关试剂：购自(invitrogene)；转染试剂HD：为Roche产品；抗beta;-actin多克隆抗体：为santa产品。 　　1.2方法 　　首先，进行细胞培养，采用DMEM培养基{FBS（10%）、温度为37摄氏度、氧气（5%）}来培养肝癌SMMC-7221细胞，并对细胞的生长情况做以观察及记录、每两天更换一次基液，之后做代传培养后取细胞实验；其次是进行重组质粒的转染；三是采用激光共聚焦的显微镜对基因转染率做判定；四是对SMMC-7721的细胞beta;-catenin-siRNA其表达采用半定量RT-PCR做以监测后再用Western做蛋白含量分析；最终对细胞生长的情况采用MTT做检测。 而在对细胞凋亡的实验中，前两步骤相同，第三步骤开始为对SMMC-7721的细胞其凋亡采用流式细胞技术做监测；四是对SMMC-7721的细胞beta;-catenin-siRNA、bcl-2、caspase-3其表达采用半定量RT-PCR（分组）做以监测。 　　统计学处理 采用SAS9.1软件对数据进行分析，本实验的设计为重复测量，总体均存在交互作用，组内比较采用重复测量分析, 组间比较采用SNK-q检验。以a=0.05为检验水准。Plt;0.05统计学上有显著差异，Pgt;0.05统计学上无显著差异。 　　2. 结果 　　2.1 重组质粒转染SMMC-7721细胞后细胞凋亡情况 　　beta;-连环素-siRNA重组质粒转染SMMC-7721凋亡细胞后SMMC-7721细胞凋亡率较对照组比明显增加，细胞凋亡发生于转染后48h, 72h凋亡率达最高, 无时间依赖性，较对照组比明显增加。 　　2.2沉默beta;-连环素后肝癌细胞株SMMC-7721中caspase-3、bcl-2、Survivin mRNA表达结果 　　针对beta;-