产细菌素乳杆菌的筛选鉴定与培养条件的优化研究.pdfVIP

882 第五届博士生学术年会论文集 产细菌素乳杆菌的筛选鉴定与培养条件的优化。 贡汉生孟祥晨 东北农业大学乳品科学教育部重点实验室，黑龙江省哈尔滨市，150030 摘 要 从内蒙古传统乳制品发酵稀奶油中分离出一株产细菌素的乳杆茵 KLDSl．0364，初步鉴定为布氏乳杆菌。优化乳杆菌产细菌素的条件，确定了有最大抑茵活力 时的培养时间、培养温度和培养基成分，即30C培养24h；最佳培养基氮源为1％胰蛋白胨、 0．5％蛋白胨、0．5％牛肉膏、0．5％酵母提取物，最佳碳源为葡萄糖。 关键词 乳杆菌 细菌素 筛选鉴定 乳酸菌代谢产生的很多物质，如有机酸、过氧化氢、双乙酰和细菌素等，都可以通过改变食品的内在 特性来抑制腐败菌的生长。人们很久以前就开始认识和使用这些终产物保护食品安全。细菌素是某些 细菌产生的抑菌肽或蛋白，可以杀灭和抑制与之相同或相似生境的其他微生物。虽然许多细菌都能产 生细菌素，但乳酸菌产生的细菌素更适合在食品工业中应用。现在只有几种商品化的细菌素面市，如 nisin和pediocinPA一1。目前所研究的乳酸菌细菌素主要对革兰阳性细菌有抑制或杀死作用，对革兰阴 性细菌、酵母菌、霉菌及病毒一般没有抑制作用。因而只能用于抑制革兰阳性细菌引起的食品腐败，不 能抑制由大肠杆菌、沙门氏菌、志贺氏菌等革兰阴性细菌引起的食品腐败变质。另外，许多细菌素如ni— sin在食品中应用抑菌活性不太稳定，限制了其在食品工业中的发展。所以，我们要继续大力开发其他 乳酸菌细菌素。 我国内蒙古自治区拥有几千年的乳制品生产历史，生产的传统乳制品中含有丰富的乳酸菌资源。 从传统乳制品中筛选出产细菌素的乳酸菌，对于开发我国乳酸菌资源，获得自主知识产权的生物防腐 剂，保护食品安全具有重要的意义。本文目的在于从分离自内蒙古传统乳制品中的乳酸菌中筛选高产 细菌素的乳酸菌，并通过优化培养条件提高其细菌素产量。 一、材料与方法 (一)材料 1．供试菌株 分离自内蒙古传统乳制品中的67株乳杆菌，乳品科学教育部重点实验室工业微生物菌种保藏 定所。 2．培养基 乳杆菌选择MRS培养基培养，金黄色葡萄球菌ATCC25923用营养琼脂培养基培养。 ① 国家。十一五“863”科技计划资勋项目(No．2006AAl02344)． 化学与化工 883 3．主要试剂与设备 ALPHA Nucleic ANALYZER。 离心机，CHRIST 1-4型冻干机，DU800acid／Protein (二)方法 1．产细菌素菌株初筛 平板，放置干燥；试验菌在适宜液体培养基中及适宜培养条件下培养过夜；倾倒的平板干燥后，在平板上 点种lOlL培养过夜的试验菌菌液；在洁净工作台上干燥，干燥后放人适宜条件下培养24h左右，待长 出菌落取出；制备0．7％琼脂的适宜软琼脂培养基(指示菌培养基)，冷至50。C左右；按每7mL软琼脂培 养基接种300弘L指示菌过夜培养液为比例，接种指示菌；在长出菌落的试验菌平板上倾倒7mL上述加 入指示菌的软琼脂，放冷，干燥；放人适宜培养条件下培养过夜，产生的抑菌环半径大于5mm认为有抑 菌活性。 2．无细胞发酵上清液的制备 将活化并纯化后培养的乳杆菌以1％接种量接种于MRS液体培养基中，30。C静置培养到稳定期 (OD 酸的干扰。上清液用0．22肚m滤膜过滤，除去菌体及其他杂质，无细胞上清液通过冷冻干燥的方法浓 缩，冻干后加入原体积1／10的灭菌水，溶解后放人一20。C冰箱中备用。 3．有抑菌活性菌株的复筛 台中晾干；制备含0．7％琼脂适宜指示菌生长的软琼脂培养基，冷却至50℃左右；每lOOmL软琼脂培养 基接种1mL过夜培养的指示菌；在底层有琼脂的平皿上倾倒6mL含有指示菌的软琼脂培养基，晾干； 用打孔器在涂有指示菌的培养基上打孔，孑L直径6ram；在孑L中加入无细胞发酵上清液，洁净工作台上放 置3h；置于适宜培养条件下进行培养；用游标卡尺测定抑菌圈直径。 4．排除过氧化氢的干扰 过氧化氢酶溶解在0．02mol／L的乙酸盐缓冲液(pH6．5)中配成母液，加入无细胞发酵上清