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RNA 干扰概述RNA interference 05级生物技术二班 赵宇 RNAi介绍 RNAi的历史 RNAi的概念 RNAi的机制 RNAi的应用、问题及前景 RNAi的历史 (矮牵牛花的故事 ) 20世纪90年代，在对矮牵牛（petunias）进行的研究中有个发现：Rich Jorgensen和同事将一个能产生色素的基因置于一个强启动子后，导入矮牵牛中，试图加深花朵的紫颜色，结果没看到期待的深紫色花朵，多数花成了花斑的甚至白的。因为导 RNAi的历史(线虫中的基因沉默现象) 1995年，美国康乃尔大学的Su Guo博士和Kemphues试图利用反义RNA技术阻断秀丽新小杆线虫（C.elegans）中的par-1基因，但却得到了一个意想不到的结果。在对照实验中给线虫注射正义RNA（sense RNA）以期观察到基因表达的增强。但得到的结果是二者 直到1998年华盛顿卡耐基研究院的Andrew Fir和马萨诸塞大学医学院的Craig Mello等首次揭开这个悬疑之谜。他们证实，Guo等遇到的正义RNA抑制基因表达的现象，以及过去的反义RNA技术对基因表达的阻断，都是由于体外转录所得RNA中污染了微量双链RNA而引起。当他们将体外转录得到的单链RNA纯化后注射线虫时发现，基因抑制效应变得十分微弱，而经过纯化的双链RNA却正好相反，能够高效特异性 RNAi的机制 现有的RNAi作用机制模型包括两个阶段： 1）起始阶段 2）效应阶段 1）起始阶段 2）效应阶段 siRNA双链结构解旋并结合一个核酶复合物（该核酶复合物由内切核酸酶、外切核酸酶、解旋酶和同源RNA搜索活性蛋白四种成分组成。），形成RNA诱导的沉默复合物（RNA-induce silencing complex,RISC）。在siRNA 解双链即RISC激活过程需一个ATP。活化以后的 被切割后的断裂mRNA 随即降解,从而使该基因的表达受抑,这就是转录后的基因沉默(post -transcription gene silencing ,PTGS) 。 RNAi的应用 目前已将RNAi技术用于代谢性疾病包括糖尿病及其慢性并发症、肥胖症和脂代谢异常等研究。例如,Noh等用siRNA干扰转化生长因子β(TGF-β)后,高血糖所诱发的鼠肾小球系膜细胞中TGF-β的表达、血浆纤溶酶原激活剂抑制物-1(PAI-1)及I型胶原的表达均有所减少,提示针对TGF-β的siRNA可作为治疗糖尿病肾病的工具。 肿瘤的基因治疗： 肿瘤是多个基因相互作用的基因网络调控的结果，传统技术诱发的单一癌基因的阻断不可能完全抑制或逆转肿瘤的生长, 而RNAi可以利用同一基因家族的多个基因具有一段同源性很高的保守序列这一特性, 设计针对这一区段序列的dsRNA分子，只注射一种dsRNA即可以产生多个基因同时剔除的表现，也可以同时注射多种dsRNA而将多个序列不相关的基因同时剔除。 研究基因功能的新工具 已有研究表明RNAi能够在哺乳动物中灭活或降低特异性基因的表达，制作多种表型，而且抑制基因表达的时间可以随意控制在发育的任何阶段，产生类似基因敲除的效应。线虫和果蝇的全部基因组序列已测试完毕，发现大量未知功能的新基因，RNAi将大大促进对这些新基因功能的研究。与传统的基因敲除技术相比，这一技术具有投入少，周期短，操作简单等优势，近来RNAi成功用于构建转基因动物模型的报道日益增多，标志着RNAi将成为研究基因功能不可或缺的工具。 防御病毒的感染 dsRNA出现在许多病毒（包括单链RNA病毒）感染的细胞内，诱发RNAi,封闭病毒生存和繁殖所必需的基因，产生抗病毒效应。siRNA 可望成为防治病毒的有力工具，尤其是对RNA 病毒基因治疗：RNAi 作用的高度特异性有可能特异地抑制致病的突变等位基因，但又不影响正常的等位基因。 存在的问题 RNAi在疾病治疗中的应用尚存在一些问题,最主要的障碍是如何研制有效的给药系统将siRNA分子准确传送到靶组织。在体外实验中所使用的siRNA转染方法也不一定适用于体内环境,因此转运成为RNAi 治疗的一个主要障碍。还有诸如安全性、治疗效能等问题都有待一一解决。 RNAi的应用前景 尽管目前RNAi技术在哺乳动物中的应用还处于探索阶段，但它在斑马鱼和老鼠等脊椎动物中的成功应用预示着RNAi将成为基因治疗中重要的组成部分，而且所有细胞都存在RNAi机制,几乎所有基因都可成为潜在的治疗靶点。并且RNAi 治疗疾病具有特异性高、应用广泛等诸多优点, 因此在内分泌代谢病治疗中的应用和人工合成的dsRNA寡聚