红桂木凝集素的免疫调节作用初探.docVIP

精品论文 参考文献 红桂木凝集素的免疫调节作用初探 李璐 刘小芹 曾麒燕（通讯作者） （广西医科大学基础医学院生物化学与分子生物学教研室 广西南宁 530021） 【摘要】目的 研究红桂木凝集素(ALL)对小鼠的免疫调节作用。方法 首先，在无菌条件下提取Balb/c小鼠骨髓细胞，分离单个核细胞，以重组粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(rmGM-CSF)和白细胞介素4(rmIL-4)协同诱导下培养，培养至第六天，添加TNF-a或者ALL继续培养两天。CCK-8法检测细胞增殖；倒置显微镜观察细胞生长变化；ELISA法测培养上清中IL-12、IFN-gamma;的分泌水平。其次，小鼠皮内注射OVA和/或ALL；两周后断尾取血，酶联免疫夹心法(ELISA)检测小鼠血清中OVA特异性IgG的浓度。结果 ALL能显著促进小鼠骨髓来源树突状细胞(BmDC)的增殖；并促进BmDC分泌细胞因子IL-12、IFN-gamma;； 但不能增强OVA在小鼠体内产生特异性抗体的量。结论 ALL在细胞免疫中具有很好的促进BmDC成熟及增殖的作用，但不能增强小鼠对OVA的特异性体液免疫应答。 【关键词】红桂木凝集素 树突状细胞 免疫调节 【中图分类号】R392 【文献标识码】A 【文章编号】2095-1752（2013）09-0074-02 红桂木为桑科桂木属（波罗蜜属）植物，产于广东、海南、广西等地，药用具有活血通络，清热开胃，收敛止血的功效[1]。我教研室周德义教授等通过对植物种子进行筛选，首次发现桂木种子含有丰富的能使兔、羊和豚鼠等动物的红细胞和人红细胞强烈凝集的凝集素,并做了较系统的基础研究[2]。红桂木凝集素(artocarpus lingnanensis lectin)是一种性质稳定、凝集活性高的植物凝集素。本课题组前期研究发现ALL能有效抑制急性淋巴细胞白血病Jurkat T细胞的生长[3]，且能有效促进人外周血单核细胞来源的树突状细胞的成熟及增殖[4]。树突状细胞是目前发现的体内最强的抗原提呈细胞，能激活初始T细胞，在诱导特异性免疫过程中起着重要作用[5]。树突状细胞与肿瘤的发生、发展有着密切关系。为了更好的研究ALL的免疫调节作用，在本实验中，以Balb/c小鼠为研究对象，用ALL刺激BmDC，观察ALL对BmDC生长的影响；并检测IL-12、IFN-gamma;水平；体内实验以卵清蛋白(ovalbumin, OVA)为抗原,对Balb/c小鼠皮内接种免疫，观察ALL能否增强OVA的免疫效果。 1 材料与方法 1.1 实验小鼠：Balb/c小鼠，雄性，4-6周龄，广西医科大学实验动物中心提供。 1.2 试剂与仪器：红桂木种子，采自广西药用植物研究所；ALL由本实验室自行提取；RPMI-1640细胞培养液、胎牛血清（FCS）、青-链霉素双抗，购于美国Hyclone公司；重组小鼠粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(rmGM-CSF）、重组小鼠白细胞介素4（rmIL-4），购于美国Peprotech EC公司；细胞增殖检测试剂盒（cell couningkit-8, CCK-8）,购于碧云天生物技术研究所；红细胞裂解液，购于solarbio公司；卵清蛋白（OVA），购于sigma公司；辣根酶标记山羊抗小鼠IgG，购于北京中杉金桥生物技术有限公司；小鼠白细胞介素-12/P40(IL-12/P40)、gamma;干扰素（IFN-gamma;）ELISA定量测试剂盒，购于R＆D。 1.3 实验方法 1.3.1 BmDC的分离和培养：无菌条件下分离小鼠股骨和胫骨，用RPMI1640冲洗出骨髓细胞，吹打细胞悬液，4deg;C，1300rpm/min 离心5min，弃去上清。加入3-5ml红细胞裂解液，置冰上3min，RPMI1640洗细胞两次，将细胞用含15ng/ml的rmGM-CSF、15ng/ml的rmIL-4、10%FCS和1%双抗的RPMI1640培养基（完全培养基）悬浮后，用(100times;20mm)培养皿培养，置于37deg;C，5%CO2培养箱中，隔天半量换液。 1.3.2 ALL对BmDC生长的影响：按照上述培养方法培养至第六天，将细胞悬液分至96孔细胞培养板中（每孔100ul，每组5个复孔）做如下分组：①ALL组:加入ALL使其终浓度分别为22.5ug/ml、90ug/ml、225 ug/ml。②TNF-alpha;组：加入TNF-alpha;使其终浓度为50ng/ml。③对照组：加入等体积RPMI1640。培养48h后。倒置显微镜下观察各组细胞并于培养结束前3h加入CCK-8，每