第9章 动物基因工程.ppt

第九章 动物基因工程 ;第一节 动物细胞基因工程 ;一、动物细胞表达体系 动物细胞表达系统主要由宿主细胞和表达载体两部分组成。 1 表达载体 目前常用的表达载体分为病毒载体与质粒载体。病毒载体是以病毒颗粒的方式，通过病毒包膜蛋白与宿主细胞膜的相互作用使外源基因进入宿主细胞内。常用的病毒载体有 ： （1）逆转录病毒（Retrovirus）载体 （2）腺病毒（Adenovirus，AV）载体 （3）腺相关病毒（Adeno-associated Virus，AAV）载体 （4）质粒载体 ;2 宿主细胞 虽然至今批准的由动物细胞表达的产品，其宿主细胞几乎都是CHO细胞。但是在实践中，人们发现它也存在着一些不足， 因此，近来一些具有良好特征的细胞系都已被作为宿主细胞试用于真核细胞的表达系统中。;（2）CHO-K1细胞 该细胞是CHO细胞的一株缺乏二氢叶酸还原酶（dhfr—）的营养缺陷突变株，它可以在氨甲蝶呤(MTX）压力下使外源基因的基因拷贝数扩增，使外源蛋白质得到较高水平表达。 ;（4）MDCK细胞 该细胞是从成年雌性的西班牙长耳狗的肾脏分离获得，是具有贴壁依赖性的上皮样细胞，已成功地在微载体上增殖。该细胞能支持多种病毒的增殖，已被用来生产兽用疫苗。 ;二、动物细胞表达载体的构建 目的基因在哺乳动物细胞中的表达受整合目的基因的染色体区域的状态、目的基因的拷贝数及目的基因的转录、翻译和翻译后加工修饰效率的影响。构建一个高效表达的哺乳动物细胞表达载体，应从表达载体在染色体上整合位点的优化，转录翻译效率的提高以及目的基因拷贝数的增加等方面综合考虑。下面分别从转录水平和翻译水平的调控元件、整合位点的优化以及增加目的基因拷贝数等方面对此作一介绍。 ;1. 转录水平 在目的基因拷贝数一定，整合位点固定的情况下，转录作为基因表达的第一步，提高转录效率对一个高效表达载体的构建来说显得尤为重要。启动子及其相应增强子、转录终止信号及多聚腺苷酸加尾信号对转录水平的高低及mRNA的稳定性有很大影响，其中强启动子、强增强子是提高转录水平的关键因素。 在转录过程中，转录因子通过DNA 结合结构域特异识别并结合目标基因的特异调控序列，通过转录激活结构域调节或将转录作用因子募集至启动子从而启始基因的转录和表达。因此，提高宿主细胞转录因子的表达水平也能增强目的基因的表达。 ;2. 翻译水平 除了转录水平的调控外， 翻译水平的调控和翻译产物的加工修饰的效率等也对目的基因的表达产生重要的影响。Ploy（A）的存在不但能影响mRNA稳定性，而且也能部分起“翻译增强子”的作用，提高mRNA 翻译水平；内部核糖体进入位点（IRES）能使同一mRNA中除第1个基因之外的其他基因也得到有效表达；翻译增强子可提高翻译效率；通过使用宿主细胞偏好的密码子来对目的基因的密码子进行优化也可以大幅度提高翻译效率。;3. 整合位点的优化 目的基因在细胞染色体上整合位点区域的状态对于目的基因的表达与否、表达高低以及目的基因在宿主细胞中的稳定性起着决定性的作用。只有那些整合位点处于染色体转录活跃区的细胞形成的克隆才可高水平表达目的基因。因此，保证将表达载体整合在 细胞染色体上转录活跃位点的克隆被挑选出来，是提高细胞表达水平必需的一步，主要通过以下几种策略实现。 ;一是通过选择基因（如neo、dhfr）的弱化表达； 二是在载体上添加染色体上的某些特定序列，使表达载体整合到宿主细胞的染色体后能模拟染色体的高转录活跃区 ； 三是先将含有定点重组位点的选择标记基因整合在染色体高表达区，然后将表达目的基因的表达载体和表达重组酶载体共转染上述带有重组位点的细胞系。;4 增加目的基因拷贝数 单拷贝或低拷贝目的基因，无论表达载体调控元件如何优化、整合的染色体位点多么合适，其外源基因表达量都是有限的。因此，通过增加目的基因拷贝数来获得高表达重组药物的工程细胞株是基因工程药物研究中不可或缺的一步。目的基因的扩增常采用目的基因和选择标记基因共扩增的方法， ;三、动物细胞转化方法与筛选 1 基因的导入方法 在真核细胞的表达研究中，细胞转染是一个关键步骤。在基因治疗中，也需要用基因转移技术导入外源基因。因此该技术的研究已越来越受到重视，至今已开发了许多新的技术和方法。不同的细胞系，摄取和表达外源DNA 的能力可相差几个数量级。因此如果采用某种特定的细胞系，就务必比较几种不同方法的效率。当前用于DNA转染哺乳动物细胞的主要方法见下表。; 真核细胞转染方法;（1）光穿孔法 光穿孔法（optoporation）是利用激光产生的热量，使细胞壁产生孔洞，将外源物质导入细胞。 （2）冲击波法 冲