第二章-基因工程制药.ppt

3、 凝胶层析 它是将样品化合物通过一定孔径的凝胶固定相，用于流经体积的差异，使不同分子量的组成得以分离的层析。 其介质是凝胶珠，内部是多孔的网状结构。凝胶的交联度（网孔大小）决定了凝胶的分离范围；有时也用排阻极限来表示分级范围的上限。例如SephadexG-50的分级范围是1500-30000。凝胶的粒度和洗脱速度及分辨率有关。 目前经常使用的凝胶有：交联葡聚糖、聚丙烯酰胺凝胶和琼脂糖等。交联葡聚糖是由线性α-1，6-葡聚糖与1-氯-2，3-环氧丙烷反应交联而成的化合物，它的商品名为Sephadex。聚丙烯酰胺凝胶（商品名是Bio-gel P）是一种人工合成的凝胶。琼脂糖是一种天然凝胶，它是从一种海藻多糖—琼脂或种洋菜中分离得到的。 凝胶过滤原理 当不同大小的蛋白质颗粒流经凝胶柱时，比凝胶网孔大的分子不能进入凝胶珠内的网状结构，而被排阻在凝胶珠外，随着溶剂在凝胶珠之间的空隙向下移动并最先流出柱外；比网孔小的分子能不同程度地自由出入凝胶珠的内外。这样由于不同大小的分子所经的路径不同而得到分离，大分子物质先被洗脱出来，小分子物质后被洗脱出来 ，如下图。 大分子 小分子 凝胶颗粒 凝胶排阻示意图解 第五节 基因工程菌生长代谢的特点 菌体生长是菌体各成分尤其是生物大分子——核酸和蛋白质合成的综合表现，通常用比生长速率表示。 碳源、补料或稀释速率可调控菌体生长。控制菌体生长对提高质粒的稳定性、减少代谢副产物的积累、提高外源蛋白产率方面都具有一定的意义。 对菌体生长地调控主要有两种观点：1.认为能量地供应决定了菌体的最大比生长率；2.认为是小分子前体和催化组分的限制决定了菌体地最大生长速率。 一、菌体的生长和能量的关系 各种碳源通过有限地呼吸能力所能提供地最大能量决定了菌 体在这种培养基中的最大比生长速率。 当菌体生长所需能量大于菌体有氧代谢所能提供地能量 时，由于呼吸链或三羧酸循环地供应不足，使部分乙酰辅酶A 通过转化为乙酸来功能功能，菌体往往会产生代谢副产物乙 酸。高浓度地乙酸能明显地抑制菌体的生长。 分批培养中选用不同的碳源，补料培养中通过控制补料速 度，连续培养中通过控制稀释速率等培养方法，提高菌体摄氧 能力，改变TCA中的关键酶活性，关闭乙酸合成途径等，从而 控制乙酸的产生，在一定范围内控制菌体生长，减少它的抑制 作用，以实现工程菌的高密度培养和提高重组产物的表达平。 二、菌体生长与前体供应的关系 基因表达在各个水平的竞争是各个基因互相竞 争共同的前体和催化结构的结果。 对于基因工程菌来说，外源基因与宿主菌自身 基因的竞争表达。 质粒存在对菌体代谢的影响：中拷贝质粒，三 羧酸的关键酶相对增加。原因：终产物反馈调节。 前体浓度的降低，导致这些酶浓度增加。 高拷贝质粒：前体、关键酶、延伸因子浓度下 降，菌体比生长速率，总蛋白合成均减少，这与 大量前体被利用，前体不足，“严谨反应”。 第六节 基因工程菌的不稳定性 分裂不稳定和结构不稳定 一、质粒不稳定产生的原因 分裂不稳定：指工程菌分裂时出现一定比例不含质粒的子代菌的现象。 与两个因素有关：一是含质粒菌产生不含质粒菌的频率，质粒丢失率与宿主菌、质粒特性和培养条件有关；二是两种菌比生长速率差异的大小。 结构不稳定是DNA从质粒上丢失或碱基重排、缺失所致工程菌性能的改变。同源重组、串联启动子、培养条件等。 质粒稳定性分析方法：先在不含抗性标记培养基中培养，再于含抗性标记培养基中培养，根据比值计算质粒的稳定性。 二、提高质粒稳定性的方法 1.选择合适的菌株 2.选择合适的载体 低拷贝质粒载体，要增加拷贝数。 高拷贝质粒载体，适当提高比生长速率，使拷贝数降低，增加稳定性。 3.在培养基中加入选择性压力如抗生素等，以抑制质粒丢失菌的生长，也是提高质粒稳定性的方法。 4.分阶段控制培养 为提高培养过程中质粒的稳定性，一般采用两阶段法，第一阶段先使菌体生长至一定密度，第二阶段诱导外源基因的表达。 5.采用适当的操作方式可使工程菌生长速率具有优势，并使工程菌和质粒丢失菌生长竞争趋于极端化。可调控的环境参数为温度、pH、培养基组分和溶解氧浓度。通过间隙供氧和改变稀释速率都可以提高质粒的稳定性。 二、提高质粒稳定性的方法 6.固定化 可以提高基因重组大肠杆菌的稳定性。固定化后，质粒的稳定性及目的基因产物的产率都有了很大提高。 二、提高质粒稳定性的方法 第八节 重组基因工程菌培养 基因工程菌的培养过程主要包括：①通过摇瓶操作了解工程菌生长的基础条件，如温度、pH、培养基各种组分以及碳氮比，分析表达产物的合成、积累对受体细胞的影响；②通过培养罐操作确定培养参数和控制的方案和顺序。 一、