海洋真菌碱性脂肪酶液态发酵和部分酶学性质研讨.pdfVIP

发酵工程学科的进展 ——第四次全国发酵工程学术讨论会论文集 海洋真菌碱性脂肪酶液态发酵和部分酶学性质研究 穆文侠1’2，郑 敏2，潘仁瑞2，朱兴德2，张丽丽2，刘斌2，蔡敬民1’2 (1．安徽农业大学生命科学学院，合肥230036；2．合肥学院生物与环境工程系．合肥230022) 摘要：从海洋菌中分离筛选到一株碱性脂肪酶产生菌H一19，对该菌产脂肪酶的液态发 酵条件进行了优化，优化后的培养基组成(％)：葡萄糖0．5，小麦粉0．5，豆饼粉1．0，橄榄油 1．0，NaCl 0．5，KCl0．1，MgS04·7H200．2，CaCl20．05，(NH·)2So|0．5；发酵 2．75，MgCl2 培养基起始pH8．0，发酵温度28℃，播床转速180r／rain，发酵周期48小时，脂肪酶的活力可 达17．43IE『／mL．酶的最适反应pH为9．0，最适温度36℃． 关键词：海洋真菌H一19}碱性脂肪酶；液态发酵}酶学性质 泛存在于动物、植物各种组织及许多微生物中，能催化水解、酯化、转酯化和醇解等一系 列不同类型的反应，在食品，轻工，皮革，造纸，医药，能源，手性化合物的拆分与合成等领 域有广泛的应用‘卜钉。目前，脂肪酶主要采用微生物发酵法生产。多数脂肪酶产生菌是 从土壤，油脂厂，工农业废水废渣等处筛选得到，而从海洋中筛选得到脂肪酶产生菌的报 道较少，且多数是细菌和酵母“一5]。本文从青岛海域附近采集的样品中筛选分离得到一 株产脂肪酶的海洋真菌，经过对其酶学性质的初步研究发现为碱性脂肪酶且最适作用温 度较低，这对作为洗涤添加剂有着广泛的应用前景。并对其液态发酵条件进行优化，为 后续工作的研究打下基础。 1 材料与方法 1．1菌种 海洋真菌H一19从青岛浅海滩采集后分离纯化。 1．2培养基 1．2．1斜面保种培养基：PDA培养基 1．2．2斜面产孢培养基：葡萄糖6％，马铃薯60％，琼脂2％，人工海水[6]1000mL 至8．0。 基金项目：安徽省优秀青年科技基金；合肥学院科研发展基金 作者简介：穆文侠(1982一)女，微生物学硕士研究生． 蔡敬民(1963一)男，通讯作者Email,caijingmin@hfuu．edu．cn 朱兴德、张丽丽分别为2006届。2005届本科生 668 第四次全国发酵工程学术讨论会 1．2．3分离霉菌培养基：PDA培养基(加人工海水) 1．2．5液态发酵基础培养基(％)： 葡萄糖0．5，豆饼粉1．5，人工海水(装液量60／250mL) 1．3方法 1．3．1分离方法：将试样稀释至一定浓度，取0．1mL涂布在PDA平板上，28℃培养2 天，分离单菌落，斜面保存。 1．3．2产脂肪酶菌株的筛选方法：将保存的斜面菌株稀释至一定浓度，取0．1mL涂布 于油脂同化平板上，28℃培养2天，取菌周围蓝绿圈较大者，接到斜面保存。 1．3．3碱性脂肪酶活力测定方法：见参考文献[7] 1．3．4可溶性蛋白浓度测定：见参考文献[8] 2结果与讨论 2．1产酶菌种的分离与筛选 对50个在山东海域采集的水样，海泥，海沙，海藻等样品进行筛选分离，找出一株产 酶活较高的霉菌菌株H一19，其在维多利亚蓝的平板上所产的蓝绿圈较大。将其挑出平 板划线，分离纯化后进行液态发酵条件的优化。 2．2发酵培养基的优化 2．2．1碳源对产酶的影响 以发酵起始培养基为基础，改变碳源种类，测定酶活力。发现以葡萄糖加小麦粉作 为碳源产酶活较高(见表1)。进一步研究了葡萄糖浓度梯度对产酶的影响，发现葡萄糖 浓度在0．5％时产酶活最高。另外，实验证明复合碳源可以延长产酶周期，在48—64h产 酶稳定。 2．2．2氮源对产酶的影响 在有机氮源中豆饼粉最好I在无机氮源中，(NH。)。S04的效果最好；复合氮源较单一 氮源的效果好。但是考虑到生产成本，氮源选豆饼粉为宜(见表2)。实验结果表明：在含 脲的培养基中H一19生长很差，可能是脲对H一19的生长有抑制作用。进一步研究发 现豆饼粉在1％时酶活达到最高。 表1 碳源对H—19产碱性脂肪酶的影响 表2 氯源对H—19产碱性脂肪酶的影响