苦参碱对人横纹肌肉瘤RD细胞CXCR4 mRNA表达的影响.docVIP

精品论文 参考文献 苦参碱对人横纹肌肉瘤RD细胞CXCR4 mRNA表达的影响 金明卫 玄承敏 安 琪 　　（徐州市儿童医院 徐州 221006） 　　【摘 要】目的：研究苦参碱对人横纹肌肉瘤RD细胞株中CXCR4 mRNA的表达及影响，明确苦参碱的抗肿瘤作用是否通过抑制CXCR4 mRNA的表达而发挥作用。方法：应用不同浓度苦参碱分别作用RD细胞株48h；采用MTT比色法检测不同浓度苦参碱对RD细胞的增殖抑制率；流式细胞仪(FCM)检测RD细胞的凋亡率； RT-PCR检测CXCR4mRNA表达。结果：不同浓度苦参碱干预组及对照组RD细胞的抑制率、凋亡率以及CXCR4 mRNA 表达差异均有统计学意义（Plt;0.05）；随苦参碱浓度增加，细胞的抑制率和凋亡率呈上升趋势，而CXCR4 mRNA 表达呈下降趋势，差异均有统计学意义（Plt;0.05）。结论：苦参碱可以抑制RD细胞CXCR4 mRNA的表达，苦参碱的抗肿瘤作用是通过抑制CXCR4mRNA的表达而发挥作用。 　　【关键词】苦参碱；横纹肌肉瘤；表达 　　【中图分类号】R738.7 【文献标识码】B 【文章编号】1003-5028（2015）6-0412-02 　　本实验主要观察苦参碱对体外人横纹肌肉瘤RD细胞株增殖和凋亡的影响，研究苦参碱对CXCR4基因的影响，初步了解CXCR4基因是否参与苦参碱的抗肿瘤作用，为进一步研究苦参碱用于横纹肌肉瘤的治疗研究提供新的治疗靶点。 　　1 材料和方法 　　1.1材料 人横纹肌肉瘤RD细胞株购自上海中科院细胞库；Mat（纯度ge;98％）购自陕西中鑫生物科技有限公司；RPMI 1640培养液购自杭州吉诺生物医药技术有限公司；胎牛血清购自杭州四季青公司；MTT、DMSO和Trizol等试剂购自美国Sigma公司；细胞凋亡检测试剂盒购自碧云天生物技术研究所；CXCR4一抗购自武汉博士德生物工程有限公司；Trizol、RT-PCR 两步法试剂盒、2times;Taq PCR Master Mix、溴化乙锭（EB）、TBE和DNA Marker等试剂购自北京天根生化科技有限公司；PCR引物由上海捷瑞生物工程有限公司合成。 　　1.2方法 　　1.2.1细胞培养 RD细胞接种于10%胎牛血清的RPMI 1640培养液中，于37℃，5%CO2，饱和湿度的恒温培养箱中传代培养，取对数生长期细胞用于实验。 　　1.2.2分组（1）对照组：仅有等量细胞及培养基，无药物即A组（2）药物干预组：苦参碱浓度分别为0.5，1.0，1.5，2.0（单位g/L）即为B、C、D、E组（3）空白组：仅有等量培养基及溶剂，无细胞（此分组仅见于MTT实验中）。 　　1.2.3MTT检测细胞增殖抑制率　将细胞接种于96孔板，每孔150ul，贴壁后各处理组加入50ul苦参碱继续培养48h；后各孔加入20ulMTT工作液，继续置于培养箱培养4h；吸去上清液，每孔加入150ulDMSO，振荡10min后在1h内于酶标仪检测492nm波长时各孔吸光度(A值) ,并计算细胞抑制率（IR):IR（％）=(对照组A值-实验组A值)/对照组A值times;100%。 　　1.2.4FCM 检测RD细胞凋亡率 将细胞接种于六孔板，每孔2ml，贴壁，处理48h后收获细胞，PBS洗两遍并离心(1000rpm、5min)，加入500mu;l Binding Buffer悬浮细胞，再加5mu;l Annexin-V-FITC混匀后，加入5mu;l PI，室温，避光，染色15min后，1h内用流式细胞仪检测各组细胞凋亡率。 　　1.2.5 RT-PCR检测RD细胞CXCR4 mRNA的表达 取对数生长期细胞提取总RNA进行逆转录，然后进行PCR扩增：CXCR4引物上游序列：5rsquo;-CTGCCCTCCTGCTGACTATTCC-3rsquo;，下游序列：5rsquo;-ATGATGTGCTGAAACTGGAACAC-3rsquo;（扩增目的基因长度为127bp）；beta;-actin引物上游序列: 5rsquo;-CGAAACTACCTTCAACTCCATC-3rsquo;，下游序列5rsquo;-AGTGATCTCCTTCTGCATCCT-3rsquo;（扩增目的基因长度为130bp）；扩增条件：94℃预变性 3min，94℃变性30sec，55℃退火30sec,72℃延伸1min，共35个循环，最后72℃延伸5min；扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳，利用电脑成像统计电泳后泳带密度，以目的基因与beta;-actin扩增产物的灰度值的比值表示基因表达水平。 　　1.2.6统计学处理 以上实验均重复3次，计量资料以均数plusmn;标准差（chi;plusmn;s）表