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生物物理目1透射电子显微镜2冷冻电镜（Cryo-TEM）录3软物质蛋白质电镜样品制备方法4蛋白质结构探测确定的电镜方法56Electron tomgraphyTransmission Electron Microscope 透射电子显微镜是它是一种高分辨率、高放大倍数的显微镜，它可以看到在光学显微镜下无法看清的小于0.2nm的细微结构，最早由E.Ruska等人发明。1932年，Ruska发明了以电子束为光源的透射电子显微镜，电子束的波长要比可见光和紫外光短得多，并且电子束的波长与发射电子束的电压平方根成反比，电压越高波长越短。它现在是材料科学研究的重要手段，能提供极微细材料的组织结构、晶体结构和化学成分等方面的信息。透射电镜的分辨率为0.1～0.2nm，放大倍数为几万～几十万倍。由于电子易散射或被物体吸收，故穿透力低，必须制备更薄的超薄切片（通常为50～100nm）。其制备过程与石蜡切片相似，但要求极严格。　透射电子显微镜与光学显微镜电镜的分类大型透射电镜大型透射电镜（conventional TEM）一般采用80-300kV电子束加速电压，不同型号对应不同的电子束加速电压，其分辨率与电子束加速电压相关，可达0.2-0.1nm，高端机型可实现原子级分辨。低压透射电镜低压小型透射电镜（Low-Voltage electron microscope, LVEM）采用的电子束加速电压（5kV）远低于大型透射电镜。较低的加速电压会增强电子束与样品的作用强度，从而使图像衬度、对比度提升，尤其适合高分子、生物等样品；同时，低压透射电镜对样品的损坏较小。分辨率较大型电镜低，1-2nm。由于采用低电压，可以在一台设备上整合透射电镜、扫描电镜与扫描透射电镜冷冻电镜冷冻电镜通常是在普通透射电镜上加装样品冷冻设备，将样品冷却到液氮温度（77K），用于观测蛋白、生物切片等对温度敏感的样品。通过对样品的冷冻，可以降低电子束对样品的损伤，减小样品的形变，从而得到更加真实的样品形貌。透射电镜的结构原理 透射电镜的总体工作原理是：由电子枪发射出来的电子束，在真空通道中沿着镜体光轴穿越聚光镜，通过聚光镜将之会聚成一束尖细、明亮而又均匀的光斑，照射在样品室内的样品上；透过样品后的电子束携带有样品内部的结构信息，样品内致密处透过的电子量少，稀疏处透过的电子量多；经过物镜的会聚调焦和初级放大后，电子束进入下级的中间透镜和第1、第2投影镜进行综合放大成像，最终被放大了的电子影像投射在观察室内的荧光屏板上；荧光屏将电子影像转化为可见光影像以供使用者观察。冷冻电镜（Cryo-TEM）冷冻电镜，就是用于扫描电镜的超低温冷冻制样及传输技术(Cryo-SEM)可实现直接观察液体、半液体及对电子束敏感的样品，如生物、高分子材料等。样品经过超低温冷冻、断裂、镀膜制样（喷金/喷碳）等处理后，通过冷冻传输系统放入电镜内的冷台（温度可至-185℃）即可进行观察。其中，快速冷冻技术可使水在低温状态下呈玻璃态，减少冰晶的产生，从而不影响样品本身结构，冷冻传输系统保证在低温状态下对样品进行电镜观察。样品准备用于冷冻电镜研究的生物大分子样品必须非常纯净。生物样品是在高真空的条件下成像的，所以样品的制备既要能够保持本身的结构，又能抗脱水、电子辐射。一种方法是通过快速冷冻使含水样品中的水处于玻璃态，也就是在亲水的支持膜上将含水样品包埋在一层较样品略高的薄冰内。该方法有两个关键步骤：一是将样品在载网上形成一薄层水膜；二是将第一步获得的含水薄膜样品快速冷冻。在多数情况下，用手工将载网迅速浸入液氮内可使水冷冻成为玻璃态。其优点在于将样品保持在接近“生活”状态，不会因脱水而变形；减少辐射损伤；而且通过快速冷冻捕捉不同状态下的分子结构信息，了解分子功能循环中的构象变化。另一种方法是通过喷雾冷冻装置（spray-freezing equipment），利用结合底物混合冰冻技术 (spray-freezing)，可以把两种溶液（如受体和配体）在极短的时间内混合起来 (ms量级)，然后快速冷冻，将其固定在某种反应中间状态，这样能对生物大分子在结合底物时或其他生化反应中的快速的结构变化进行测定，深入了解生物大分子的功能。数据采集冷冻电镜拍摄的图像图册冷冻的样品通过专门的设备——冷冻输送器转移到电镜的样品室。在照相之前，必须观察样品中的水是否处于玻璃态，如果不是则应重新制备样品。由于生物样品对高能电子的辐射敏感，照相时必须使用最小曝光技术（minimal exposure technic）。要得到高分辨率的电镜图像，照相时累积的电子剂量不能超过临界剂量1000到2000e-nm-2;中等分辨率的电镜图像图像不能超过临界剂量 10000e-nm-2。 最小曝光技术要求首先在低放大倍数下寻找合适的区域；光学对位和聚焦应在邻