分子生物学分子生物学实验2014章节.pptVIP

分子生物学实验 实验目录 实验 一 植物基因组DNA提取及纯化 实验 二 PCR克隆目的基因 实验 三 PCR产物琼脂糖凝胶电泳 实验 四 PCR产物凝胶回收 实验 五 目的基因片段与载体连接 实验 六 E.coli DH5α和 DE3感受态细胞制备 实验 七 连接产物转化转化大肠杆菌 实验 八 阳性单菌落筛选 实验 九 重组质粒DNA提取 实验 十 重组质粒及表达载体pET酶切分析与电泳 实验十一 目的片段回收及与表达载体连接 实验十二 连接产物转化DH5α,质粒提取 实验十三 阳性质粒转化表达菌株BL21 实验十四 蛋白质的诱导表达及蛋白质样品制备 实验十五 SDS检测诱导表达的蛋白质 实验一 植物基因组DNA提取 基本原理 1. 基因组DNA 的提取通常用于构建基因组文库、Southern 杂交及PCR 分离基因等。 2.不同生物（植物、动物、微生物）的基因组DNA 的提取方法有所不同; 不同种类或同一种类的不同组织因其细胞结构及所含的成分不同，分离方法也有差异。 3. 在提取某种特殊组织的DNA 时必须参照文献和经验建立相应的提取方法, 以获得可用的DNA 大分子。尤其是组织中的多糖和酚类物质对随后的酶切、PCR 反应等有较强的抑制作用,因此用富含这类物质的材料提取基因组DNA 时, 应考虑除去多糖和酚类物质。 4.核酸是生物有机体中的重要成分，在生物体中核酸通常与蛋白质结合在一起，以核蛋白的形式存在。核酸分为DNA和RNA，在真核生物中，前者主要存在于细胞核中，后者主要存在于细胞质和核仁里。在制备核酸时，通过研磨破坏细胞壁和细胞膜，使核蛋白被释放出来。 5. 植物基因组DNA的提取程序： （1）破碎组织 （2）破坏细胞膜 （3）去除杂质 （4）沉淀基因组DNA 本实验是通过SDS法提取拟南芥基因组DNA。 二 实验目的 1.通过SDS提取拟南芥基因组DNA; 2.为从拟南芥基因组DNA克隆目的基因作准备 仪器、材料和试剂 仪器及耗材： 研钵、微量移液器及吸头、EP管、台式离心机。 材 料： 拟南芥小苗 试 剂： DNA Extract Buffer (0.2M NaCl, 25mM EDTA, 0.5% SDS, pH 7.5); 70%乙醇；酚；氯仿；异丙醇;RNase 实验步骤 1. 取一定量的拟南芥组织; 2. 加入600 μl抽提缓冲液（0.2M NaCl, 25mM EDTA, 0.5% SDS, pH 7.5），室温下快速研磨; 3. 把抽提液从研钵中移至1.5 ml 离心管中，混匀; 4. 12,000 rpm, 离心10 min (RT)。取上清，加等体积的酚/氯仿（1：1）混合液，上下颠倒混匀； 5. 12,000 rpm, 5min (RT) ，取上清，加等体积的异丙醇，上下颠倒混匀； 6. 12,000 rpm, 10min (RT) ，弃上清，倒置于吸水纸上待壁上液体流尽后加入1ml的70%乙醇洗沉淀； 7. 12,000 rpm, 5 min (RT) ，弃上清，倒置于纸巾上待其干燥； 8 加20 μl ddH2O溶解沉淀; 9.在溶解DNA中加入3-5 μl RNase，37℃消化2-3h； 10.补充ddH2O至总体积400 μl ，加入等体积的酚/氯仿，混匀； 11.12000rpm，5min（RT），取上清入新的EP管中，用等体积的氯仿再抽提一次； 12.取上清，加入1/10体积的乙酸钠和2倍体积的无水乙醇，-20 ℃放置10min。 13.12000rpm，4 ℃离心10min； 14.去上清，70%乙醇洗涤沉淀； 15.去上清，沉淀干燥后，加入20 μl ddH2O溶解DNA； 16.分光光度计法检测DNA的浓度和纯度。 注意事项 （1）选用幼嫩植物组织，可减少淀粉类的含量。 （2）植物组织充分匀浆。 （3）DNA的二级结构和双链易受多种因素的影响引起双链解开，即“变性”，因此抽提时避免使用变性的条件。 （4）抑制内外源DNase的活力。 （5）防止化学降解。 （6）防止物理因素降解。。 思考题 .1在拟南芥基因组提取缓冲液中，EDTA和SDS的作用分别是什么？ 实验报告分析 A260=1时相当于50 μg的双链DNA。 A260/A280=1.8，DNA纯度高。 A260/A2801.7，有蛋白质的污染。 A260/A2801.9,有RNA的污染或者降解。 A260/A230在2.0—2.5，DNA纯度高。 A260/A2302.0,有糖类，盐类或者有机溶