基因治疗2.pptVIP

三、基因干预 Gene Interference 主要干扰特定细胞的mRNA转录和翻译 基因干预的种类： 1.反义RNA (antisense RNA) 2.干扰RNA (RNA interference) 3.核酶 (ribozyme) （一）反义RNA 1. 反义RNA与基因表达调控 利用反义RNA对体外培养的细胞进行基因表达调控，通常采用的方法有两种： （1）体外合成反义RNA，直接作用于培养细胞，细胞吸收RNA后，发挥作用。 缺点：RNA易降解 （2）构建能转录反义RNA的重组质粒，将质粒转入细胞，转录出反义RNA而发挥作用 缺点：细胞内转录的反义RNA量不易控制 反义基因治疗 DNA DNA  RNA RNA 反义RNA 阻断表达 （二）干扰RNA（干涉RNA） RNA干扰（RNA interference， RNAi）是一种由双链RNA诱发的基因沉默现象。在此过程中，与双链RNA有同源序列的信使RNA（mRNA）被降解，从而抑制该基因的表达。 2个步骤： 1、小干扰性RNA（siRNA）：长双链RNA被细胞内的双链RNA特异性核酸酶Dicer切成21-23个碱基对的短双链RNA。 2、siRNA与细胞内的某些酶和蛋白质形成复合体，称为RNA诱导的沉默复合体。该复合体可识别与siRNA有同源序列的mRNA，并在特异的位点将该mRNA切断。 （三）核酶(ribozyme)用于基因治疗 天然核酶多为单一的RNA分子，具有自我剪切作 用。但核酶也可以由两个RNA分子组成。 在基因治疗时，利用核酶分子结合到靶RNA分子中适当的邻位，形成锤头核酶结构，将靶RNA分子切断，通过破坏靶RNA分子达到治疗疾病（如清除病毒基因组RNA）的目的。 只要两个RNA分子通过互补序列相结合，形成锤头状的二级结构（3个螺旋区），并能组成核酶的核心序列（13个或11个保守核苷酸序列），就可在锤头右上方产生剪切反应。 锤头型核酶的二级结构和空间立体结构示意图 三个双螺旋区 13个核苷酸残基保守序列 剪切反应在右上方GUX序列的3‘端自动发生 （N代表任意核苷酸，H代表A,U或C） 基因治疗新进展 1.病毒介导的基因转移系统 病毒载体介导的基因转移效率较高，因此它也是使用最多的基因治疗载体。据统计，有72%的临床实验计划和71%的病例使用了病毒载体，其中用得最多的是逆转录病毒载体。 感染细胞 Retrovirus （1）逆转录病毒 主要有逆转录病毒（Retrovirus, RV）、慢病毒 （Lentivirus, LV）、腺病毒（Adenovirus, AV）、 腺相关病毒（Adeno-Associated Virus, AAV）等。 LTR gag pol env ψ LTR 长末端 重复序列 调节和 启动转录 产生病毒 核心蛋白 产生 逆转录酶 产生病毒 外膜蛋白 包装信号 DNA前病毒的结构特征 U5 R U3 U3=增强子，R=启动子，U5=转录起始位点 (1)保留病毒颗粒的包装信号而缺失病毒蛋白基因 (2) 辅助细胞株，产生病毒包装蛋白。 包装细胞主要有： ψ—2 PA317 ψCRIP Retroviral packaging system 逆转录病毒载体的特点 ①逆转录病毒包膜上由e