靶向沉默CTGF基因对胰腺癌细胞Panc-1侵袭的影响.docVIP

精品论文 参考文献 靶向沉默CTGF基因对胰腺癌细胞Panc-1侵袭的影响 长安大学医院 710061 【摘 要】目的 探讨靶向沉默CTGF基因对人胰腺癌细胞Panc-1侵袭的影响及可能机制。方法 通过小干扰RNA转染胰腺癌细胞Panc-1，Transwell小室侵袭试验检测各组Panc-1细胞的侵袭能力，Western blot检测及real-time PCR检测细胞侵袭相关蛋白E-cadherin、vimentin、MMP-9和uPA蛋白和mRNA的表达水平。结果 靶向沉默CTGF基因可明显抑制Panc-1细胞侵袭能力，同时明显上调E-cadherin水平，并显著下调vimentin、MMP-9和uPA蛋白及mRNA水平。结论 靶向沉默CTGF基因可抑制胰腺癌细胞Panc-1的侵袭，可能与其抑制EMT过程及侵袭相关分子MMP-9和uPA有关。 【关键词】胰腺癌；侵袭；CTGF；RNA干扰 在肿瘤细胞中，CTGF（结缔组织生长因子）被认为参与肿瘤的多种生物学过程，包括增殖、血管形成及失巢凋亡过程。最新研究发现CTGF也参与了乳腺癌、黑色素瘤等多种肿瘤的形成和发展过程[1]。CTGF蛋白参与胰腺癌的增殖，运用CTGF抗体可抑制裸鼠胰腺癌模型的进展[2]，提示CTGF蛋白胰腺癌发生发展中扮演重要角色。本研究旨在通过靶向沉默胰腺癌细胞Panc-1的CTGF基因，探讨CTGF在胰腺癌侵袭中的作用。 1 材料与方法 1.1 材料 人胰腺癌细胞株Panc-1细胞购来自中国科学院上海生命研究所。DMEM培养基、胰蛋白酶、胎牛血清均购自美国sigma公司。兔抗人MMP-9多克隆抗体，兔抗人uPA多克隆抗体均购自美国Bioworld公司，鼠抗人beta;-actin单克隆抗体，HRP标记山羊抗鼠IgG、山羊抗兔IgG二抗均购自美国CST公司。CTGF siRNA和对照siRNA Control购自上海吉玛公司。聚偏二氟乙烯膜（PVDF膜），Transwell小室均购自Milliproe公司。转染试剂Lipofectamine 2000购自Invitrogen公司。PCR引物合成于北京鼎国生物公司。 1.2 细胞培养与转染 人胰腺癌细胞Panc-1于含10%胎牛血清的DMEM培养液中，37℃，5%CO2培养，2~3天用0.25%胰酶消化传代。取对数生长期的细胞进行试验。细胞分3组：常规培养的未转染正常对照组、转染siRNA Control的阴性对照组、转染siRNA Notch1基因沉默组。转染方法按Lipofectamine 2000的说明书进行。 1.3 Transwell小室侵袭试验 以预冷的DMEM与Matrigel胶1：1稀释后，取100 mu;l稀释胶加到Transwell上层小室中，于37℃孵育6 h。收集各组细胞，消化成单细胞悬液，用含1%胎牛血清的DMEM培养基重悬，按5times;104个细胞/ml的密度100 mu;l接种于Transwell上层小室。吸取含10%胎牛血清的DMEM培养基500 mu;l加入Transwell下层小室，置于37℃，5% CO2的培养箱中培养24h。用棉签沾PBS轻轻地擦去小室上层聚碳酸酯膜上贴壁生长但未能穿过膜的细胞。将膜取出放入预先装有10%甲醇的24孔板内固定10 min。吸弃乙醇，加0.1%的结晶紫染色15 min，用PBS小心洗去多余的染料，翻转聚碳酸酯膜，小心撕下，晾干，置载玻片上加中性树胶盖玻片封片。在200倍放大倍数下随机观察并计10个视野内穿过聚碳酸酯膜的细胞数，照相记录。重复3次。 1.5 Western blot检测蛋白表达 选择生长良好的细胞1times;107个，蛋白裂解液裂解细胞，提取细胞总蛋白。BCA法测定蛋白浓度。SDS凝胶电泳，半干转膜法转至PVDF膜。5％脱脂牛奶室温封闭1 h。加一抗稀释液4℃孵育过夜。TBST缓冲液洗膜后加入二抗稀释液室温孵育1 h。ECL化学发光显影。 1.6 real-time PCR检测mRNA水平 用Trizol-氯仿-异丙醇法提取各组细胞总RNA。取5 mu;g按反转录试剂盒说明反转录为cDNA。以cDNA为模板real-time PCR扩增CTGF、E-cadherin、vimentin、MMP-9、uPA，以beta;-actin为内参照。各目的基因引物序列如下：CTGF：5rsquo;-ACCTGTGGGATGGGCATCT-3rsquo;，5rsquo;-CAGGCGGCTCTGCTTCT CTA-3rsquo;；E-cadherin：5rsquo;-ATTCTGATTCTGCTGCTCTTG-3rsquo;，5r