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GM试验培训课件;;; （一）曲霉菌感染现状 曲霉感染不容忽视;（二）曲霉菌感染现状曲霉感染死亡率高;二ＧＭ的检测原理;（一）ＧＭ的检测原理;（一）ＧＭ的检测原理 ;三实验操作流程;5.漩涡混合仪 6. 100μL和300μL多道移液器（排枪）及配套吸头：可以减少不同孔的加样时间差。如果使用洗板机，无需用300μL多道移液器。 7. 100μL和1000μL单道移液器及配套吸头 8.配制洗液的量筒和保存洗液的试剂瓶 9.封板膜：需用户根据每盒试剂做实验次数自备一部分备用 10.浮漂：沸水浴使用 ;（一）试剂盒组成;（一）试剂盒组成;（二）GM实验操作流程图;样本处理 1.向离心管中加入300μl待测血清。 2.向离心管中加入l00μl样本处理液R5。 3.漩涡震荡10s以彻底混匀，将离心管放入水浴锅100℃加热3min。 4.将离心管从水浴锅内取出，小心放入离心机内 ，10000r离心10min。 5.取上清液50μl用于检测。 ;取300μL血清;1.实验前将试剂盒取出置于室温30min 2.配液： （1）洗涤工作液： 浓缩洗液稀释20×（l份浓缩洗液R6加l9份的无菌去离子水或超纯水） （2）半乳甘露聚糖抗体工作液： 半乳甘露聚糖抗体稀释100×（l份半乳甘露聚糖抗体R3b加99份的半乳甘露聚糖抗体稀释液R3a）； （3）酶标抗体工作液：酶标抗体50×（l份酶标抗体R4b加49份的酶标抗体稀释液R4a）； ;3.样本混合： ;4.洗涤酶标板： 揭开封板膜，洗涤酶标板。每孔每次加入250μl的洗液，静置2min后，将酶标板孔内的液体除去，在吸水纸上反复拍打以去除残留液体，重复上述洗涤操作，共洗涤3次。 5.加入稀释后的酶标抗体：洗涤结束后，每孔加入酶标抗体100μl。用封板膜封板，37℃下孵育40±1min。 6.洗涤：同步骤4 ;7.显色：洗涤结束后，每孔加入底物溶液100μl，不用封板膜封板，在37℃下孵育20min，避光。 8.终止：每孔加入50μl终止液，加样顺序与加入底物顺序相同，混匀后，在OD450nm处读数。 ;阳性：GM≥0.95μg/L 阴性：GM0.75μg/L 灰区：0.75≤GM0.95μg/L，建议连续多 次检测并应结合临床资料综合评价; R2a：试验OD值控制在1.0±0.4； R2e：试验OD值控制在0.4±0.2； 空白对照：试验OD值控制在0.1以下。 标准曲线：r2≥0.96 如果没有达到上述指标，则影响分析的 可靠性，检测结果不予报告，需重新检测。 ;GM检测曲霉的优势;四GM试验的注意事项及影响因素; 6.严格按说明书要求控制孵育温度及时间，不能随意变动。 7.试剂盒中显色试剂---TMB底物溶液（R8）易氧化，尽量缩短开盖时间且避免强光照射，若溶液颜色变为浅蓝色时（正常使用时应为无色），应弃用。 8.终止液具腐蚀性，易发生灼伤，操作时请注意人身安全。 9.各产品同时使用时，除浓缩洗液及终止液外，请勿将同一名称试剂互相替代使用。 ;（二）GM试验的影响因素; 造成GM实验假阴性的因素主要有： 抗原过多，出现后带现象 抗原和抗体形成免疫复合物 释放入血的半乳甘露聚糖不持续，很快被清除 局部感染，包括慢性肉芽肿 菌丝少，侵血管性弱 抗真菌药物使用（如两性霉素B、三唑类药物），抑制菌丝生长从而减少GM分泌 非粒细胞缺乏患者 ;可能造成GM实验假阴性的因素 1.曲霉菌生长和抗原释放与周围环境的营养条件和pH有关。如果营养充分，pH在7.5，真菌可持续生长并释放GM，但是当炎症发展时，真菌生长受到抑制， GM释放会减少。 2.GM 抗原与血液中的某些物质结合遮蔽了与抗体相结合的抗原决定簇。 Mennink-Kersten MA, Donnelly JP, Verweij PE. Detection of circulating galactomannan for the deagnosis and management of invisive aspergillosis. Lancet Infect,2004,4(6):349-359 ;可能造成GM实验假阴性的因素： 3.宿主的抗真菌治疗：检测前是否进行抗真菌的治疗是关系到实验灵敏性的重要因素。 Marr等对67位患者的986份血清进行分析，发现在未接受抗真菌治疗的患者里面ELISA方法的敏感度可达到80% ，而经抗真菌治疗患者的敏感度仅为20%。 Marr KA, Balajee SA, Mcl aughlin L, et al. Detection of galactomannan antigenemia by enzym