实验6醋酸纤维素薄膜电泳.pptVIP

醋酸纤维素薄膜电泳 ;【原理】  带电粒子在电场中向与其电性相反的电极泳动的现象称为电泳。由于血清中各种蛋白质的等电点不同，因此在同一pH环境中所带负电荷多少不同，又由于其分子大小不同，所以在电场中泳动速度也不同。分子小而带电荷多者，泳动速度较快；反之，则泳动速度较慢。 因此通过电泳可将血清蛋白质分为5条区带，从正极端依次分为清蛋白、α1球蛋白、α2球蛋白、β-球蛋白和γ球蛋白等，经染色可计算出各蛋白质含量的百分数。 醋酸纤维素薄膜电泳具有微量、快速、简便?、分辨率高等优点，广泛应用于血清蛋白、血红蛋白、糖蛋白、脂蛋白、结合球蛋白、同工酶的分离和测定。 ;【操作】  1.?准备??将缓冲液加入电泳槽的两槽内，并使两侧的液面等高。裁剪尺寸合适的滤纸条，叠成四层贴在电泳槽的两侧支架上，一端与支架前沿对齐，另一端侵入电泳槽的缓冲液内，使滤纸全部湿润，此即?“滤纸桥” ;将醋酸纤维素薄膜切成2cm×8cm大小，在无光泽面的一端约1.5cm处，用铅笔轻划一直线，作为点样位置。然后将无光泽面向下，置于盛有巴比妥缓冲液的培养皿中浸泡，待充分浸透（约20分钟）即无白色斑点后取出，用洁净滤纸轻轻吸去表面的多余缓冲液。 2. 点样? 用加样器取少量血清(约2～3μl)，加在点样线上，待血清渗入膜内，移开加样器。点样时应注意血清要适量，应形成均匀的直线，并避免弄破薄膜; 3.?平衡与电泳??将点样后的薄膜有光面朝上，点样的一端靠近负极，平直地贴于电泳槽支架的滤纸上，平衡约5分钟。盖上电泳槽盖，通电进行电泳。调节电压为100～160伏，夏季通电45分钟，冬季通电60分钟，待电泳区带展开2.5～3.5cm时断电。 ; 4.?染色??用无齿镊小心取出薄膜，浸于染色液中1～3分钟（以清蛋白带染透为止）。染色过程中应轻轻晃动染色皿，使薄膜与染色液充分接触，薄膜量较多时，应避免彼此紧贴而影响染色效果。 ;5.?漂洗??准备好培养皿，装入漂洗液。从染色液中取出薄膜，依次在漂洗液中连续浸洗数次，直至背景无色为止。将漂净的薄膜用滤纸吸干，从正极端起依次为清蛋白（A）、α、α、β及γ-球蛋白（图3-3）。 ;6.定量?? ?????(1)洗脱法：取6支试管，编号，分别为A、α、α、β、γ和空白管。于清蛋白管加入0.4mol/LNaOH溶液4ml,其余5管加2ml。剪下各条蛋白区带，另于空白部分剪一条与各蛋白区带宽度近似的薄膜作为空白，分别浸入各管中，振摇数次，置37℃水浴20分钟，使色泽完全浸出。用620nm波长以空白管调零比色，读取各管吸光度，按下式计算： T?=?A×2?+?α?+?α?+?β?+?γ  清蛋白%?＝?清蛋白管吸光度×2/T×100 α-球蛋白%?＝?α -球蛋白管吸光度/T×100 α-球蛋白%?＝?α -球蛋白管吸光度/T×100? β-球蛋白%?＝?β-球蛋白管吸光度/T×100 γ-球蛋白%?＝?γ-清蛋白管吸光度/T×100? ;【正常参考值】 ????清蛋白：?????????? ?57.45～71.73% ????α1-球蛋白：?????????1.76～4.48% ????α2-球蛋白：?????????4.04～8.28% ????β-球蛋白：????????? ?6.79～11.39% ????γ-球蛋白：??????????11.85～22.97% ???? A/G????????????????? 1.24～2.36? 【临床意义】 1.急慢性肾炎、肾病综合征、肾功能衰竭时，清蛋白降低，α1、α2和β-球蛋白升高； 2.慢性活动性肝炎、肝硬化时，清蛋白降低，β、γ-球蛋白升??；急性炎症时，α1、α2-球蛋白升高； 3.慢性炎症时，清蛋白降低，α2、γ-球蛋白升高； 4.红斑狼疮、类风湿关节炎时，清蛋白降低，γ-球蛋白显著升高； 5.多发性骨髓瘤时，清蛋白降低，γ-球蛋白升高，于β和γ-球蛋白区带之间出现“M”带。 ;电泳失败的常见原因： 1.电泳图谱不整齐：点样不均匀；薄膜未完全浸透或温度过高致使膜面局部干燥或水分蒸发；缓冲液变质；电泳时薄膜放置位置不正确，未与电流方向平行。 2.蛋白各组分分离不佳：点样过多或过少；电流过低；薄膜结构过分细密，透水性差，导电差 3.染色后白蛋白中间着色浅：染色时间不足或染色液陈旧；蛋白含量高。 4.薄膜透明不完全：透明液陈旧；浸泡时间不够；