第二章-----基因工程文档.pptVIP

鸟枪法：先用物理方法(如剪切力、超声波等）或酶化学方法（如限制性内切核酸酶）将生物细胞染色体DNA切割 成为基因水平的许多片段，继而将这些片段与适当的载体结合，将重组DNA转入受体菌扩增，获得无性繁殖的基因文库，再结合筛选方法，从众多的转化子菌株中选出含有某一基因的菌株，从中将重组的DNA分离、回收。 * 基因文库的构建程序 基因组DNA的制备 为了最大限度地保证基因在克隆过程中的完整性， 用于基因组文库构建的DNA在分离纯化操作中应尽量 避免过度的断裂。 * 基因文库的构建程序 基因组DNA的切割 用于基因组文库构建的DNA片段的切割一般采用超声波处理和 限制性内切酶部分酶切两种方法，其目的是： 第一保证DNA片段之间存在部分重叠区 第二，保证DNA片段大小均一 超声波处理后的DNA片段呈平头末端，需加装人工接头 * 基因文库的构建程序 载体和受体的选择 用于基因组文库构建的载体通常选装载量较大的l-DNA或考斯质粒； 对于大型基因组（如动植物和人类）需使用YAC或BAC载体 l-DNA 上述几种载体的最大装载量如下： 质粒 考斯质粒 15 kb 25 kb 45 kb BAC 300 kb YAC 400 kb 用于基因文库构建的受体则根据载体使用大肠杆菌或酵母菌 * 基因文库的构建程序 从基因文库中筛选目的基因 大型基因组文库一般由数十万甚至上百万个重组克隆组成。除 了一些具有特殊功能的蛋白质编码基因（如抗药性基因、结合蛋白 编码基因等）可以采用特殊的正选择筛选程序（如抗药性筛选法、 酵母双杂交技术等）直接筛选外，一般的基因组文库筛选均需多轮 操作步骤 * * 4、逆转录法： 逆转录法即利用逆转录酶由mRNA逆转录合成 的方法。 主要是合成分子量大而又不知道其序列的基因。 方法：与目的基因的mRNA为模板——借助逆转录酶合成互补双链DNA分子，即cDNA（单链）——再在DNA聚合酶的作用下合成双链DNA片断——与适当的载体结合后转入受体菌——扩增为cDNA文库——采用适当的方法从cDNA文库中筛选出目的基因。如家兔和从的珠蛋白质基因等。 * * * 5、聚合酶链技术（PCR） 聚合酶链技术（PCR）是1985年美国加利福尼亚的Mullis等到人开发的一项专利技术。 PCR（Polymerase Chain Reaction）法，又称为聚合酶链反应或PCR扩增技术，是一种高效快速的体外DNA聚合程序。 使用PCR法克隆目的基因的前提条件是：已知待扩增目的基因或DNA片段两侧的序列，根据该序列化学合成聚合反应必需的双引物 * 定义：是指在四种脱氧核苷三磷酸（dNTP）存在下，以单链DNA为模板与寡聚核苷酸为引物，经DNA聚合酶催化合成DNA互补链的过程。 PCR的操作体系：双链模板DNA（即目的基因）、热稳定的DNA聚合酶；一对引物和合成时所需要的原材料（dNTP） 方法：高温变性 ? 低温退火（50-60 ℃ ） ? 适温延伸（72 ℃） * * * * * PCR的特点 （1）特异性强 ① PCR使用专门合成的DNA引物。 ② 延伸过程是在高温下进行。 （2）敏感性高 这就避免了一般DNA聚合酶污染和非引物延伸形成的DNA。提高了反映的特异性。 需要的模板量极低 ,理论上只要一条模板链，32次循环就可合成约109条 * RT-PCR： 对模板的纯度要求低。 （5）可以扩增mRNA （4）简便 先用逆转录酶将mRNA合成cDNA，再以cDNA为模板进行扩增。 （3）快 整个PCR过程约4小时即可完成。 不需要纯化，甚至可以直接用细菌。已固定或包埋的组织切片也可以直接用于作模板。 * 1、质粒载体（Plasmid Uector）： 质粒的基本特征 质粒是生物细胞内固有的、能独立于寄主染色体而自主复制、并 被稳定遗传的一类核酸分子 质粒常见于原核细菌和真菌中 绝大多数的质粒是DNA型的 绝大多数的天然DNA质粒具有共价、封闭、环状的分子结构， 即cccDNA 质粒DNA的分子量范围：1 - 300 kb * 质粒的自主复制性 质粒能利用寄主细胞的DNA复制系统进行自主复制 质粒DNA上的复制子结构决定了质粒与寄主的对应关系 根据在每个细胞中的分子数（拷贝数）多寡，质粒可分为 两大复制类型： 严紧型复制控制的质粒 1 - 3 拷贝 松弛型复制控制的质粒 10 - 60 拷贝 * 质粒的不相容性 任何两种含有相似复制子结构的不同质粒，不能