第九章 生物技术在药用植物育种上的应用1文档.pptVIP

引物由三部分组成:(1)与人工接头互补的核心碱基序列;(2)限制性内切酶识别序列;(3)引物3’端的选择碱基序列(1～10bp)。 这样就只有那些两端序列能与选择碱基配对的限制性酶切片段被扩增,再在高分辨力的测序胶上分开这些扩增产物。 * * 简单重复序列SSR (Simple Sequence Repeats, SSR)或微卫星（microsatellite） 简单重复序(SSR)也称微卫星DNA,其串联重复的核心序列为1～6bp,其中最常见是双核苷酸重复,即(CA)ｎ和(TG)ｎ每个微卫星DNA的核心序列结构相同,重复单位数目10～60个,其高度多态性主要来源于串联数目的不同。 在基因组中存在重复序列： ◆串联重复序列（tandem repeated sequence），其重复单位首尾相连，成串排列（Flavell 1986)。 ◆散布重复序列（interspersed repeated sequence），其重复单位与其它无关序列或单拷贝序列相间排列。 * SSR标记的基本原理: 根据微卫星序列两端互补序列设计引物,通过PCR反应扩增微卫星片段, 由于核心序列串联重复数目不同, 因而能够用PCR的方法扩增出不同长度的PCR产物。 微卫星长度具有高度变异性，并且这种多态性常常表现复等位性，两端的序列多是相对保守的单拷贝序列，因而可以根据两端的序列设计一对特异引物，扩增每个位点的微卫星序列，从而揭示其长度的多态性（simple sequence length polymorphism，SSLP）。 * 一般检测到的是一个单一的多等位基因位点; 微卫星呈共显性遗传,故可鉴别杂合子和纯合子; 所需DNA量少。 显然,在采用SSR技术分析微卫星DNA多态性时必须知道重复序列两端的DNA序列的信息,如不能直接从DNA数据库查寻则首先必须对其进行测序。 优点： * * 图5 SSR标记BNLG1152在F2感病植株中的扩增图谱（琼脂糖凝胶电泳）（P1为感病亲本获白, P2为抗病亲本77Ht2，S为F2感病单株，*为交换单株，M为分子量标记） * 图6 SSR标记UMC1149在F2抗病植株中的扩增图谱（聚丙烯酰胺变性胶电泳）（P1为感病亲本获白，P2为抗病亲本77Ht2，R为F2抗病单株） * ISSR ISSR是一种新型的分子标记。与SSR相反，直接用同位素标记SSR序列，扩增2个SSR间的单拷贝序列。为了增加扩增的特异性，在引物的5′和3′端分别加入1～2个选择性碱基，引物长度16～18bp * EST EST（expressed sequence tags）是长约300~400bp的基因表达序列片段。EST技术是将mRNA反转录成cDNA并克隆到质粒或噬菌体载体构建成cDNA文库后，大规模随机挑选cDNA克隆，对其5′或3′端进行一步法测序，所获序列与基因数据库中已知序列进行比较，从而获得对生物体生长、发育、代谢、繁殖、衰落死亡等一系列生理生化过程认识的技术（Hatey 1998）。 * SNP SNP是基因中的点突变，存在的数量多，其中有些可产生RFLP，但多数突变不是发生在酶切位点。 人类基因组的编码基因中有20万个SNPs, 在非编码区的数目可能还要多10倍以上。这种标记也只有两种等位基因。 * 特性 RFLP RAPD SSR ISSR AFLP 分布 普遍存在 普遍存在 普遍存在 普遍存在 普遍存在 遗传 共显性 多数显性 共显性 多数显性 多数显性 多态性 中 高 高 高 非常高 等位检测 是 不是 是 不是 不是 检测位点数 1~3 1~10 1~5 0~50~更多 20~100 样品信息量 低~中 高 高 高 非常高 基因组区域 底拷贝编码 整个基因组 整个基因组 整个基因组 整个基因组 技术难度 中等 简单 简单 简单 中等 重复性 高 中等 高 高 高 DNA样品量 2~30μg 1~100ng 50-100ng 2~50ng 100ng 反射线 一般是 不是 不是 不是 一般是 耗费时间 慢 快 快 快 中等 可靠性 高 中等 高 高 高 * * * 三、分子标记在药用植物育种上的应用 （一）种质资源鉴定与系统发育分析 1、种质资源的鉴定 Peltier等对10个矮牵牛花杂交系和7个野生种进行了RAPD分析，来研究其遗传多样性以及这些杂交系可能起源的祖先；Steiner等利用RAPD分析中国牡丹栽培品种的遗传关系，通过聚类分析揭示中国牡丹品种可大致分为4大类，发现这些类别并不是和花型、叶型或花色分类相一致；类似的工作也在芙蓉属（Hibiscus syriacus. L）植物（ISSR）、玫瑰、丁香、荷花