第六章酶的修饰与分子定向.ppt

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第六章酶的修饰与分子定向

第六章 酶的修饰与定向进化 为什么要用人工方法改造酶 酶的稳定性 作用的最适条件 酶的主要动力学性质的不适应 特殊的应用领域 如何修饰酶分子? 人工改造酶的方法 理性设计(rational design) 化学修饰 定点突变 非理性设计(irrational design) 定向进化(directed evolution) 杂合进化(hybrid evolution) 酶分子的理性设计:利用各种生物化学、晶体学、光谱学等方法对天然酶或其突变体进行研究,获得酶分子特征、空间结构、结构和功能之间的关系以及氨基酸残基功能等方面的信息,以此为依据对酶分子进行改造。 酶分子的非理性设计:不需要正确的酶分子结构信息而通过随机突变,基因重组,定向筛选等方法对其进行改造。 本章的教学内容 第一节 酶蛋白的化学修饰 第二节 基因的定点突变 第三节 酶分子的定向进化 第一节 酶蛋白的化学修饰 一、定义 广义:凡通过化学基团的引入或除去,使蛋白质共价结构发生变化,都可称为蛋白质的化学修饰。 狭义:在分子水平上对酶进行改造,即在体外将酶的侧链基团通过人工方法与一些化学基团,特别是具有生物相容性的大分子进行共价连接,从而改变酶的酶学性质的技术称为酶蛋白的化学修饰,也称为选择性化学修饰。 二、化学修饰的目的 增强酶天然构象的稳定性减少酶热失活 保护酶活性部位与抗抑制剂 维持酶功能结构的完整性与抗蛋白酶 消除酶的抗原性及稳定酶的微环境 三、原 理 充分利用修饰剂所具有的各类化学基团的特性,或直接或经过一定的活化过程与酶分子上某种氨基酸残基产生化学反应,对酶分子结构进行改造。 四、影响蛋白质修饰化学反应的因素 影响蛋白质化学修饰反应的主要因素有两方面: 蛋白质功能基的反应活性; 修饰剂的反应活性。 影响蛋白质功能基反应活性的因素可以归纳为以下几个方面: 微区的极性; 基团之间的氢键效应; 基团之间的静电效应; 基团之间的空间阻力。 修饰剂的反应活性的决定因素 选择吸附; 静电相互作用; 位阻因素; 催化因素; 局部环境的极性。 1,修饰剂 (1)修饰剂的要求 修饰剂要有较大的分子量 良好的生物相容性和水溶性 修饰剂分子表面有较多的反应活性基团 修饰后酶活性的半衰期较长 (2)修饰剂选择的依据 选择蛋白质修饰剂要综合考虑如下一些问题: 修饰剂的水解稳定性和反应活性; 蛋白质的修饰位点,修饰剂与蛋白质上的氨基酸残基之间的反应类型和专一性; 要求的修饰度; 修饰剂与蛋白质的连接键的稳定性、毒性、抗原性; 修饰后是否需要进一步分离; 是否适于建立快速、方便的分析方法; 修饰剂是否能够简便经济地合成或购买。 (3)常用修饰剂 酰化试剂:如琥珀酸酐对氨基的修饰 烷化剂:如碘乙酸对巯基的修饰 形成酯和酰胺的试剂:如用甲醇/盐酸对羟基的修饰 氧化还原试剂:如巯基乙醇对二硫键的修饰(还原反应) 2,方 法 酶蛋白侧链的修饰 羧基的化学修饰 氨基的化学修饰 精氨酸胍基的修饰 半胱氨酸巯基的化学修饰 组氨酸咪唑基的修饰 色氨酸吲哚基的修饰 酪氨酸残基和脂肪族羟基的修饰 甲硫氨酸甲硫基的修饰 酶的亲和修饰 酶的化学交联 (1)酶蛋白侧链的修饰 蛋白质侧链上的功能基团主要有:氨基、羧基、巯基、咪唑基、酚基、吲哚基、胍基、甲硫基等。 修饰反应主要分为酰化反应、烷基化反应、氧化还原反应、芳香环取代反应。 (2)氨基的化学修饰 赖氨酸的ε-NH2是酶分子的上的敏感基团之一,易受蛋白酶的攻击。将其修饰后,可减少酶分子遭受蛋白酶攻击破坏的可能性。 氨基的烷基化是一种重要的赖氨酸修饰方法,修饰剂包括卤代乙酸、芳基卤和芳香族磺酸。 (3)酶的亲和修饰 酶的位点专一性修饰是根据酶和底物的亲和性,修饰剂不仅具有对被作用基团的专一性,而且具有对被作用部位的专一性,这类修饰剂称为位点专一性修饰制剂。 亲和试剂一般是酶的底物(或配体)的类似物。 (4)酶的化学交联 酶化学交联中的交联剂是具有两个反应活性部位的双功能基团可以在相隔较近的两个氨基酸残基之间(或酶与其它分子之间)发生交联反应。 可裂解型交联:用于多肽链的研究。 不可裂解型交联:用于固定化酶或修饰酶改善酶的生物化学性质和免疫学性质。 五、修饰反应条件 1,蛋白质与修饰剂作用的反应条件应满足如下要求: 修饰过程能够简便易行; 不引起蛋白质的不可逆变性; 尽可能提高修饰反应专一性。 2,反应条件控制 根据以上要求,反应温度、pH、反应介质和反应物配比等都要控制在一定的范围。 多数情况下,在蛋白质等电点附近的pH范围内,增加pH可以提高反应速率,降低pH可以减小反应速率。反应活性较高的修饰剂在中性或近中性的pH下即可以与蛋白质迅速偶合;而反应活性较低的修饰剂则需要较高的pH。 2,反应条件控制

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