一种新的人胚胎干细胞自身来源的滋养层支持其体外培养-论文.pdfVIP

一种新的人胚胎干细胞自身来源的滋养层 支持其体外培养1 * * 安世民 ，曾桥，滕祥云，龙志高，李娟，潘乾，邬玲仟，梁德生，夏昆， 夏家辉，张灼华 中南大学医学遗传学国家重点实验室, 长沙（410078 ） E-mail: nlmglcy@ 摘 要：通过人胚胎干细胞（human embryonic stem cells, hESCs ）经体内分化获取间充质干 细胞(mesenchymal stem cells ，MSCs)为人胚胎干细胞提供一种新的滋养层。将约 5×106 个 hESCs 注射入重症免疫联合缺陷小鼠形成畸胎瘤，8 周后再从畸胎瘤中分离MSCs 并鉴定， 将MSCs 作为hESCs 的滋养层细胞，并检测和观察hESCs 的生长情况、细胞特性和分化能 力。从畸胎瘤中获得了纯度较高的具有类似骨髓来源的MSC 特性的细胞群，其形态相似、 表面抗原标志相似(CD34 和CD45 阴性，CD29 、CD49b、CD105、CD73 和CD90 阳性) ，经 诱导可以向成骨细胞和成脂细胞分化。将hESCs 在MSCs 滋养层细胞上传代培养10 代以上， hESCs 依然具有正常的细胞形态，反转录PCR 证实其特异转录因子Oct4 、Nanog 的表达， 干细胞表面标记SSEA-1 显示为阴性，SSEA-4、TRA-1-60 、TRA-1-81 显示为阳性，碱性磷 酸酶染色显示为阳性，并且核型正常。体外EB 形成和体内畸胎瘤形成证明了其全能性。因 此来源于hESCs 本身的MSCs 可以被用来作为支持胚胎干细胞生长并维持其未分化状态的 滋养层细胞。 关键词：人胚胎干细胞，间充质干细胞，滋养层 中图分类号：Q2-33 1. 引 言 人胚胎干细胞（human embryonic stem cells, hESCs ）来自于早期的囊胚或桑椹胚, 它具 有以下两个最重要的特性：全能性和自我更新能力。该特性使得其在再生医学和器官移植等 领域具有潜在的重大意义。自从1998 年美国威斯康星大学的Thomson 教授建立世界上第一 株胚胎干细胞系到目前为止，在 NIH 已经注册了 70 株胚胎干细胞系[1] (/) 。大多数人胚胎干细胞系是培养在来源于小鼠胚胎成纤维细胞 （mouse embryonic fibroblast cells, MEF ）的滋养层细胞上，MEF 细胞通过与hESC 直接接触 及分泌多种因子维持人胚胎干细胞未分化状态。这种培养体系中的 hESCs 在应用于临床治 疗时存在多个障碍，其中之一是动物源性病原体的交叉污染[2]。因此如何建立一种人源性 的培养体系，避免治疗中动物源性污染有着重大意义。本研究通过将hESCs 进行体内分化 得到MSCs 并作为滋养层细胞，对培养在MSCs 上的hESCs 进行传代观察，以期研究和建 立一种适合于hESCs 的人源化滋养层培养体系。 2. 材料与方法 2.1 材料 2.1.1 胚胎干细胞和实验动物 本实验采用的胚胎干细胞是购自美国NIH 注册的HSF6 胚胎干细胞株，核型46,XX ；实 1本课题得到国家重点基础研究发展规划（973 ）项目（2004CB518601 ）和国家自然科学基金重点项目 ）的资助。 *并列第一作者。 - 1 - 验小鼠是购自北京维通利华动物有限公司的SCID-beige 小鼠。 2.1.2 主要试剂 Mesencult Media 购自STEM CELL 公司；胎牛血清（FBS ）、DMEM-F12 培养基购自 Gibco 公司；血清替代物(knockout serum replacement)、 Knockout DMEM 、谷氨酰胺、β-巯 基乙醇、非必需氨基酸、双抗、人碱性成纤维生长因子（basic fibrobla