第七版生物化学_第14章基因工程.pptVIP

基因重组和基因工程 Genetic Recombination and Genetic Engineering 第 一 节DNA的重组 DNA Recombination 一、概念： 基因重组：不同来源的DNA链的断裂和连接而产生的 DNA片段的交换和重新组合，形成新的DNA分子的过程。 重组类型：同源重组、特异位点重组、转座重组 二、同源重组(homologous recombination） （一）概念：发生在同源序列间的重组，通过链的断裂和 再连接,在两个DNA分子同源序列间进行单链或双链片段的 交换,称为同源重组又称基本重组。是最基本的DNA重组 方式. （二）同源重组特点： ① 不需要特异DNA序列，而是依赖两分子间序列的相 同或相似性（同源性）； ② 并且同源双链DNA分子必须紧密接触，相对应方能 交换； ③重组时，两个DNA片段必须有一个发生断裂或有一 段单链缺失。 （三）机制：Holliday模型；同源重组有4个关键步骤 ①两个同源染色体DNA排列整齐。 ②一个DNA的一条链断裂、并与另一个DNA对应链连接，形成Holliday中间体。 ③通过分支移动产生异源双链DNA。 ④Holliday中间体切开并修复，形成两个双链重组体DNA。 (四).功能 1.在减数分裂过程中，同源染色体之间进行交换，形成生物个（群）体的多样性。 2.是DNA损伤修复的重要机制之一。 2.特异位点： λ噬菌体重组的特异位点称attP(attachment site phage)，含P、O和P`三个序列组成。大肠杆菌 的重组位点attB（ attachment site bacteria），含B、O和B`三个序列。O是15bp的核心序列，是attB和attP所共同的.而其两侧的序列是B，B’和P，P`,被称为臂。整合酶与两个核心序列都相结合。 第 二 节 重组DNA技术 （二）工具酶 限制性核酸内切酶 DNA聚合酶Ⅰ 逆转录酶 T4DNA连接酶 碱性磷酸酶 末端转移酶 Taq DNA聚合酶 2.DNA连接酶(DNA ligase) ——基因工程的缝纫针 （三）目的基因 ⑴在宿主内有独立复制的能力; ⑵具有两个以上的遗传标记物，便于重组体的筛选和鉴定； ⑶拥有多种限制性核酸内切酶的单一酶切位点（多克隆位点）； ⑷分子量小，以容纳较大的外源DNA。 （5）具有适当的启动子、增强子等调控元件； （6）生物安全性好。 （一）目的基因的获取 根据已知氨基酸顺序推导出基因的核苷酸序 列，然后可用DNA合成仪人工合成目的基因。先 合成小片段，再将小片段依次连接成一个完整基 因链。人工合成方法一般适用于较短的多肽或寡 肽激素基因的合成。如胰岛素原如图 1.概念：同源重组、接合作用、转化作用、转导作用、特异位点重组、转座子、转座、限制性内切核酸酶、Ⅱ类酶识别序列、目的基因、基因载体。 2.名词：转座(transposition)、基因组DNA文库（G-文库）、配伍末端(compatible end)。 3.问题：⑴目的基因获取的途径有哪些？ ⑵目的基因与载体连接的方法有哪些？ ⑶直接筛选重组体的方法有哪些？其中针对载体的筛选方法有哪些？针对目的基因的筛选方法有哪些？ ⑷简述基因克隆的基本步骤。 一、基本工作原理 5? Primer 1 5? Primer 2 Cycle 2 Cycle 1 5? 5? 5? 5? 5? 5? Template DNA 5? 5? 5? 5? 5? 5? 5? 5? 一、基本工作原理 Cycle 3 5? 5? 5? 5? 5? 5? 5? 5? 5? 5? 5? 5? 5? 5? 5? 5? 25～30 次循环后，模板DNA的含量可以扩大100万倍以上。 载体是将外源DNA片段引入宿主细胞的运载工具或媒介。如果载体不合适，外源基因很难进入受体细胞或是进入受体细胞也不能复制和表达，所以载体的设计和应用非常重要。常用的载体是经过改造的细菌质粒、噬菌体和病毒等。 （二）克隆载体的选择和构建 克隆载体的选择和改进是一种技术性非常强的专门工作，目的不同，基因性质不同，载体的选择和构建方法也不同。 （三）外源基因与载体的连接 1.粘性末端连接 方式：(1)同一限制酶切位点连接 (2)不同限制酶切位点连接 配伍末端连接 非配伍末端连接 用限制性内切酶将载体DNA和目的基因切割后，应用DNA连接酶把目的基因接到载体DNA中形成一个完整的重组环状分子，叫