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引物设计软件oligo应用图解
引物设计软件oligo应用图解
在专门的引物设计软件中,“Oligo”是最著名的。它的使用并不十分复杂,但初学者容易被其复杂的图表吓倒。Oligo 5.0的初始界面是两个图:Tm图和ΔG图;Oligo 6.0的界面更复杂,出现三个图,加了个Frq图。“Oligo”的功能比“Premier”还要单一,就是引物设计。但它的引物分析功能如此强大以至于能风靡全世界。oligo的下载和安装我就不多说了,打开oligo相信也无需多讲。打开oligo的页面如下:
单击file菜单再点open或点击“打开”快捷图标或者用快捷键“CTrl+O”可打开下面的窗口:
在打开的OPEN窗口内选择FreqSeq再点“打开”:
选择drosfr或者其它一个文件点击“打开”:
出现以下窗口,点击“window”再点击“Tile”:
出现以下窗口,图中显示的三个指标分别为Tm、ΔG和Frq,其中Frq是6.0版本的新功能,为邻近6至7个碱基组成的亚单位在一个指定数据库文件中的出现频率。该频率高则可增加错误引发的可能性。因为分析要涉及多个指标,起动窗口的cascade排列方式不太方便,可从windows菜单改为tile方式。如果觉得太拥挤,可去掉一个指标,如Frq,这样界面的结构同于Oligo 5.0,只是显示更清楚了:
?G值反映了序列与模板的结合强度,最好引物的?G值在5端和中间值比较高,而在3端相对低(如图)。Tm值曲线以选取72附近为佳,5到3的下降形状也有利于引物引发聚合反应。Frq曲线为“Oligo 6”新引进的一个指标,揭示了序列片段存在的重复机率大小。选取引物时,宜选用3端Frq值相对较低的片段:
再点击Search再点“For Primers and probes”或使用快捷键F3:?
出现以下窗口,点“OK”就OK了。当然你也可以点击“Prameters”和“Search Range”选择你要的参数和你上下游引物的位置及你扩增产物的长度:
出现Search Status窗口,点“OK”:
出现Primer pairs窗口,#代表引物对的编号,依次为引物对所处的位置、产物的长度、最适合的退火温度、和GC的百分含量:
点击任一行出现“PCR”窗口,告知你扩增片断的位置,最合适的退火温度等等信息:
关掉“PCR窗口”和“primer Pairs窗口”回到原来的窗口你就能看到你引物的序列和位置,图中手型鼠标所指即为引物序列:
至此引物设计已经完成,你可以用“Analyse”菜单分析你的引物:有无引物二聚体、发卡结构等等:
当上下游引物全选好以后,需要对引物进行评价并根据评价对引物进行修改。首先检查引物二聚体尤其是3’端二聚体形成的可能性。需要注意的是,引物二聚体有可能是上游或下游引物自身形成,也有可能是在上下游引物之间形成(cross dimer)。二聚体形成的能值越高,越不符合要求。一般的检测(非克隆)性PCR,对引物位置、产物大小要求较低,因而应尽可能选取不形成二聚体或其能值较低的引物。第二项检查是发夹结构(hairpin);与二聚体相同,发夹结构的能值越低越好。一般来说,这两项结构的能值以不超过4.5为好。当然,在设计克隆目的的PCR引物时,引物两端一般都添加酶切位点,必然存在发夹结构,而且能值不会太低。这种PCR需要通过灵活调控退火温度以达到最好效果,对引物的发夹结构的检测就不应要求太高。第三项检查为GC含量,以45-55%为宜。有一些模板本身的GC含量偏低或偏高,导致引物的GC含量不能被控制在上述范围内,这时应尽量使上下游引物的GC含量以及Tm值保持接近,以有利于退火温度的选择。好了,oligo使用的简单介绍到此结束。 在引物设计完之后可以使用软件自带的分析功能,操作如下: 点击“File”菜单中的“New Sequence”命令; 在窗口中输入上游引物; 如果该引物的首位置不是1的话,可以在“Edit”窗口中输入新的5’端位置数字,如20; 点击Accept/Discard菜单的Accept命令; 如果引物序列长度不同于当前的引物的话,可以从“Change”菜单中改变当前的引物长度; 选取当前序列为上游引物(点击“upper”按钮); 从Edit菜单中选取“Lower Primer”命令,在Edit Lower窗口中输入下游引物的序列; 在Edit窗口的上角处,输入相应的5’位置; 选取“Accept and Quit”命令;如果想让程序给出最佳退火温度,在此时的对话框中输入PCR产物的长度以及GC含量所占百分比,一般哺乳动物的cDNA序列中GC大约占44%。点击OK就可以在“Analyze”菜单中完成各种分析了。 关于引物的评价有几点: duplex form
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