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仔猪睾丸间质细胞的 分离和培养
1
睾丸间质细胞(Leydig Cel1s, LCs)是分布于曲细精管间疏松结缔组织的一种内分泌细胞，主要生物功能是合成并分泌睾酮。
2
分离、纯化和原代培养间质细胞
纯度高
活力好
功能性良好
3
1、仔猪睾丸间质细胞的分离和培养
采集3周龄的仔猪睾丸
得沉淀
收集滤液
得沉淀
破碎、消化、过滤
离心、弃上清
PBS清洗，再离心，弃上清
培养液溶解 、吹打
分散为单细胞
200目铜网过筛
滤液
稀释至108细胞/mL
37℃，5%CO2，饱和湿度下培养
细胞进行3β-HSD酶活检测
4
5
酶消化法
胰蛋白酶
（水解细胞间的蛋白质，长时间的胰酶环境会使细胞受到损伤 ）
I、II、IV型胶原酶
（水解结缔组织中胶原蛋白成分，分离结缔组织、肌肉组织方面效果较好 ）
6
铜网过筛
间质细胞过筛可以获得较好的分离纯化效果，易贴壁，纯度较高。
活力较低，可能因为铜网过筛对细胞有一定的机械损伤 。
7
活力检测
将细胞悬液与0.4%台盼蓝溶液以9:1比例混匀。计数板计数蓝色的死细胞数和无色透明的活细胞数，以活细胞率来表示细胞活力。
台盼蓝可穿过变性的细胞膜进入细胞内，与解体的DNA结合使其着色，细胞变蓝，即为坏死
8
9
纯度检测
3β-HSD染色检测细胞纯度
3β-HSD染色液：
A液：DMSO、DHA、NBT.
B液：β-NAD、PBS
在睾丸组织中仅睾丸间质细胞内含有3β-羟类固醇脱氢酶
显微镜下细胞质中有蓝色颗粒的阳性细胞即为间质细胞
10
间质细胞形态学观察
培养24h的睾丸间质细胞(×400)
培养48h的睾丸间质细胞(×400)
11
影响间质细胞培养的其他因素
培养液的选择、接种密度、培养液的量及更换、实验操作等 。
12
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