大豆C2H2型锌指蛋白转录因子基因的克隆与鉴定.pdfVIP

摘 要 锌指蛋白是一类广泛存在于原核和真核生物体中的重要转录调控因子，在动植物的生长发育 蛋白家族中最大的一个亚族，也是真核生物转录因子中研究最多的一种与DNA或蛋白质结合的 模式结构。目前报道的植物C2H2型锌指蛋白主要参与植物各个时期的生长发育，以及胁迫应答 的调控过程。 本研究通过分析GenBank大豆EST数据库中已知的两段保守序列，发现它们的3’和5’端拼 接后其重叠部分具有100％同源性，表明它们是同一个基因序列的两个片段，该序列与已发现的 大量的植物中的C21-12型锌指蛋白保守基序具有很高的同源性。根据该序列设计特异性引物，进 行RT-PCR，获得了一个包含两段序列的eDNA开放阅读框序列，其核苷酸长度分别为516 bp， 命名为GmC2H2。GmC2H2编码一个具有172个氨基酸的蛋白，分子量约19KD。舍有两个由21 以GST融合蛋白的形式表达，纯化融合蛋白GST：：GmC2H2，进行凝胶阻滞实验，结果表明： 反向重复中的一半位点中引入两个碱基突变的突变探针结合活性有所下降，CanC=2I-12与反向重复 中的两半位点中都引入两个碱基突变的突变探针几乎没有结合活性。说明GmC2H2锌指蛋白与 核心序列EPIS特异性结合。通过设计特异性引物PCR扩增及酶切、连接等方法获得了：1个缺 失第一个保守域及与第一个保守域c端顺次衔接的7个氨基酸的突变体(命名为MZFI)、1个 缺失第二个保守域及与第二个保守域N端顺次衔接的19个氨基酸的突变体(命名为MZF2)和3 保守域C端顺次衔接的7个氨基酸、C_anC2H2蛋白第二个保守域及与第二个保守域N端衔接的 19个氨基酸对其与核心序列EPIS的结合都是必需的。而两个保守域之间的氨基酸序列组成则是 入模式植物拟南芥中发现，同期转基因型拟南芥的根长明显小于对照，但是侧根数目似乎比转入 表达不仅提高了基因型拟南芥中脯氨酸的含量，而且在低温胁迫条件下，转基因型拟南芥中以脯 氨酸为代表的多种氨基酸以及NI-i3的含量在5小时都有显著增加，且都明显高于对照，说明 GmC2I-12可能对提高植物的抗冷特性有一定的作用。 本研究克隆的GmC2H2基因，是大豆中的一个新的转录因子基因，对其性质和功能进行了初 步研究。并通过突变锌指蛋白基因，初步明确了锌指蛋白的分子作用机制。 关键词：大豆，GmC2H2转录因子，C2H2型锌指蛋白，缺失突变，胁迫 Abstract an member factorswhichexists The ofzinc is of family fingerproteinsimportant transcription in and all rolein and cukaryote．Zincproteins importantgrowth widelyprokaryote finger PLaY inbothanimalsand ofzinc isC2H2 development plants．Thebiggestsubfamilyfingerproteins as and zinc functionsa ofDNA-bindingprotein-protein (Cys2／His2)typefingerprotein，which part called or been interactiondomains．C2H2zinc theclassical type f