真核基因的大肠杆菌表达体系总结概括.pptVIP

真核基因的大肠杆菌表达体系 大肠杆菌的表达载体 克隆的真核基因在大肠杆菌细胞中的表达 影响克隆基因在大肠杆菌中表达效率的因素;大肠杆菌表达体系 克隆基因正确表达的基本条件 克隆基因表达活性的检测;真核基因的大肠杆菌表达体系;大肠杆菌表达体系 优越性: 1. 对大肠杆菌的背景知识,特别是基因表达调控的分子机理有深刻的了解; 2. 是一种安全的基因工程实验体系,拥有各类适用的寄主菌株和不同类型的载体; 3. 许多克隆的真核基因都可以在大肠杆菌细胞中实现有效、高水平的表达; 4. 大肠杆菌培养方便、操作简单、成本低廉,易用于批量生产。;具有核糖体结合位点; 具有克隆基因的功能(强)启动子; 插入序列的正确取向。;真核基因在大肠杆菌中的表达;克隆基因表达活性的检测 1.微细胞检测法; 2.巨细胞检测法; 3.偶联反应测定法。;微细胞检测法: 这是一种适于检测质粒基因表达的体内检测法。 微细胞:指由某些细菌突变体菌株在其生长期间连续产生的一类微小的圆形的无核细胞。 ; 通过蔗糖梯度离心将微细胞与正常细胞分开,含有质粒载体的微细胞是适于检测重组子质粒所携带的外源基因表达状况的理想体系。;Example: ColE1的衍生质粒(缺失了106dal), 在微细胞中不能合成出56?103dal、 42?103dal、30?103dal、 28?103dal四种多肽。其中3种多肽是大肠杆菌E1的降解产物。当一段含有EcoR1甲基化酶的DNA片断插入到卡那霉素基因内部时,便能在微细胞中合成EcoR1甲基化酶和另外2种其它的多肽分子。;巨细胞检测法 1. 经紫外线照射的大肠杆菌recA uvrA细胞,DNA停止合成,而质粒载体则可以继续合成,在紫外线照射后6小时,细胞内质粒DNA的数量增加了10倍左右,在紫外线照射后的几个小时内,加入经放射性标记的氨基酸,此时合成的蛋白质绝大部分是质粒基因所编码的。; 2. 将含有外源基因的λ噬菌体重组子,感染到事先经过紫外线严格照射的大肠杆菌细胞上。由于细胞经紫外线照射使DNA受到了损伤,自身基因的表达受到了严重的抑制。通过同λ噬菌体载体编码的蛋白质种类作比较,就可以鉴定出??隆基因编码的蛋白质产物。;偶联反应测定法 使DNA模板在细菌无细胞体系中,进行转录－转译偶联反应。经过改良的这种体系中,可以使克隆在细菌质粒或噬菌体基因组上的外源片断进行体外表达,就可以比较容易的确定多肽片断是由编码模板上的哪个小片段指导合成的。 ; 优点: 1. 放射性标记参入到蛋白质的效率,比体内标记法高的多,而且这个系统十分敏感。经35S标记的多肽分子,通过聚丙烯酰胺凝胶电泳和放射自显影若干小时后可被迅速检出; 2. 应用这个体系,其它原核生物的基因也能够得到有效的表达。;大肠杆菌表达载体;核糖体结合位点;组 成 部 分 1.启动子: 最佳启动子具备的条件 第一 必须是将启动子,能够克隆基因的蛋白质产物的表达量占细胞总蛋白的10%-30%以上 第二 这个启动子应能呈现出一种低限的基础转录水平,因为在表达毒性蛋白质或是有损于寄主细胞生长的蛋白质的情况下,使用高度抑制型的启动子是一种极为重要的条件 ;第三 这种启动子应是诱导型的,能通过简单的方式使用廉价的诱导物而得以诱导。 (IPTG);2. 转录终止子 启动子封堵作用:由一个上游启动子驱动的转录作用,当其通读过下游启动子时,便会使该启动子的功能受到抑制,将这种由一个启动子的功能活性抑制另一个启动子转录的现象,叫做启动子封堵作用。 转录终止子还能增强mRNA分子的稳定性,从而提高蛋白质产物的水平。 ;3. 转译起始序列 5’-末端结构特征,决定mRNA的转译起始效率。 在核糖体结合位点(RBS)的序列结构中,增加腺嘌呤和胸腺嘧啶脱氧核苷残基含量的比例,诱发碱基发生定点突变;或使用转译偶联系统进行克隆基因表达 ;4.转译增强子 显著的增加异源基因在大肠杆菌中的表达效率。 5. 转译终止子 mRNA转译终止必须存在终止密码子。 大肠杆菌格外偏爱使用终止子UAA,尤其是在其后加上U形成UAAU四联核苷酸的情况下,转译终止的效率便会得到进一步的增强。 ;功能启动子的分离: 一般程序: 选用一种适当的核酸内切酶,消化切割大肠杆菌的染色体DNA, 接着将切割产生的D