电镜在细胞凋亡研究中的应用.pptVIP

电镜在细胞凋亡研究中的应用Application of Electron Microscopy for Appotosis study 重庆医科大学电镜室 罗子国 一、细胞凋亡概论 1、细胞凋亡的概念 细胞凋亡（Apoptosis)或称程序性坏死（Programmed cell death, PCD)。它是不同于细胞坏死（necrosis)的另外一种死亡方式，它贯穿于生命始终。如：树木的落叶，蝴蝶的变态……,细胞凋亡不仅参与正常成年组织细胞更新（如血细胞发生、衰老细胞清除）、成年生理器官内分泌的调控（如子宫产后复旧）等重要的生 二、细胞凋亡的研究方法 三、电镜在细胞凋亡研究中的应用 在细胞凋亡发展过程中电子显微镜科观察到一系列不同于细胞坏死的形态学变化。凋亡的共同特征时细胞体积的收缩，以细胞核的形态变化尤为突出，但并不引起炎症反应。电镜下早期凋亡细胞体积缩小，失去细胞连接和一些特殊膜表面结构,如微绒毛的消失，异染色质边集，但质膜及细胞内膜依然完整。然后核体积进一步缩小，并可裂解唯一或数个致密体，与其相联的细胞质形成具有完整模型结构的凋亡小体，随之凋亡小体…… 第一部分 常规透射电镜样品制备技术 超薄切片（ultrathin-section）制备过程示意图： 培养细胞： 组织培养细胞如培养在培养瓶内的盖玻片上，可倒去培养液，加入冷的戊二醛进行固定、清洗、1%锇酸后固定、脱水和浸透。浸透以后用柔软的皱纸轻轻吸干包埋液，用刀片将盖玻片上的细胞刮下成团，放入胶囊的底部中心，再将胶囊注满包埋液，在烤箱内固化。有的细胞直接生长在培养瓶壁上，可先用0.1%的胰酶将细胞从瓶壁上分离下来，在离心管内离心成块（速度为1500～2000r/min，时间为10～15min），再进行固定，按常规方法制备。 细胞样品： 白细胞制样：经1%肝素抗凝的静脉血4～5ml，放入塑料离心管内，以1500r/min的速度离心15～20min，然后吸去表面血浆，可见淡黄色透明层，不要搅动，再沿着管壁缓缓加入戊二醛，置冰箱内固定约30min，用一段弯曲的长针，轻轻取出透明层，切成约1mm3小块，再用戊二醛进一步固定。随后可按常规样品制备方法制备。 血小板制样：取抗凝血约8～10ml，先低速离心抗凝血（400r/min，10min），得到富含血小板的血浆，把此血浆和预温到37℃的0.1%戊二醛等量混合，置37℃孵箱内半小时作轻微的表面固定。再以1500～2000r/min的速度离心10min，弃去上清液，把沉淀出的血小板用37℃的2.5%戊二醛在孵箱内固定2小时，随后步骤和常规制片相同。 * * 理过程，而且是胚胎发育、神经及免疫系统发育成熟的重要调控机制。同时细胞凋亡与增殖的失衡是肿瘤发生的重要机制。 细胞坏死是细胞突发性病理性的死亡或生理环境急聚变化（如高热缺氧等）所致。由于细胞膜的直接破坏而引起大量胞外水、电解质进入细胞内，只是细胞稳态失衡，造成细胞器特别是线粒体肿胀进而细胞破裂。如能及时去除引起细胞损伤的因素，上述早期反应尚可逆转。早期反应包括细胞凋亡对机体的许多正常生理功能具有重要意义。 诱导因素 生理及弱刺激 强烈刺激 最初表现 蛋白质合成下降 肿胀 细胞数量 单个细胞丢失 成群细胞死亡 细胞形状 形成凋亡小体 破裂成碎片 细胞形状 细胞皱缩、断裂 溶解 膜完整性 保持到最后阶段 很早消失 线粒体 完整、自身吞噬 肿胀 染色质 致密、凝聚、边缘化 分解、稀疏、固缩 细胞核 早期固缩断裂 晚期破碎 核生化改变 DNA片断化 弥散性降解 细胞器 无明