阳性克隆的PCR鉴定.pptVIP

DNA聚合酶Klenow fragment of E. Coli 则是于70年代的初期由Dr. H. Klenow 所发现，但此酶不耐高温。现今所使用的酶( Taq polymerase), 则是于1976年从 温泉中的细菌分离出来的。它的特性就在于能耐高温，是一个很理想的 酶，但它被广泛运用则于80年代之后。 PCR于1983由K. B. Mullis发展出的，Dr. Mullis 并于1985年与 Saiki 等人正式表了第一篇相关的论文。此后，PCR的运用一日千里，相关的论文发表质量可以说是令众多其它研究方法难望其项背。随后PCR技术在生物科研和临床应用中得以广泛应用，成为分子生物学研究的最重要技术。Mullis也因此获得了1993年诺贝尔化学奖。 在0.2ml RCR管内配置20ul反应体系： * * 阳性克隆的PCR鉴定 一、实验目的 掌握利用PCR技术对阳性克隆的检测技术 掌握PCR技术的原理和方法 二、相关基本知识 聚合酶链式反应(polymerase chain reaction, PCR)，是一种在体外快速扩增特定基因或DNA序列的方法。 1.变性：在加热或碱性条件下可使DNA双螺旋的氢键断裂，形成单链DNA，称之为变性。 2.退火：是模板与引物的复性。引物是与模板某区序列互补的一小段DNA片段。 3.延伸：从结合在特定DNA模板上的引物为出发点，将四种脱氧核苷酸以碱基配对形式按5’→3’的方向沿着模板顺序合成新的DNA链。 PCR产物生成量是以指数方式增加的，能将皮克(pg=10-12)量级的起始待测模板扩增到微克(ug=10-6)水平。能从100万个细胞中检出一个靶细胞；对细菌的最小检出率为3个。 PCR不需要分离病毒或细菌及培养细胞，DNA粗制品即可作为扩增模板。可直接用临床标本如血液、体腔液、洗嗽液、毛发、细胞、活组织等粗制的DNA扩增检测。 PCR反应体系 引物 dNTP Mg2+ Taq聚合酶 模板 反应缓冲液 引物设计的基本原则： 引物的长度一般为15-30 bp，常用的是18-27 bp，但不应大于38bp，因为过长会导致其延伸温度大于74℃，不适于Taq DNA聚合酶进行反应。 引物序列3’端出现3个以上的连续碱基，如GGG或CCC，也会使错误引发机率增加。 引物3’端的末位碱基对Taq酶的DNA合成效率有较大的影响。末位碱基为A的错配效率明显高于其他3个碱基，因此应当避免在引物的3’端使用碱基A。另外，两条引物3’端若互补，或者单条引物自身形成发夹结构也可能导致PCR反应失败。 5’端序列对PCR影响不太大，因此常用来引进修饰位点或标记物。可在引物设计时加上限制酶位点、核糖体结合位点、起始密码子、缺失或插入突变位点以及标记生物素、荧光素、地高辛等. 通常应在5‘端限制酶位点外再加1-2个保护碱基。 引物序列的GC含量一般为40-60%，过高或过低都不利于引发反应，因为GC含量决定了DNA双链的解链温度（Tm）。另外，上下游引物的GC含量不能相差太大。 一般PCR反应中的引物终浓度为0.2-1.0μmol/L。引物过多会产生错误引导或产生引物二聚体, 过低则降低产量。 dNTP应用NaOH 将pH调至7.0。 dNTP原液可配成5-10mmol/L并分装, -20℃贮存。一般反应中每种dNTP的终浓度为20-200μmol/L。 理论上4 种 dNTP各20μmol/L, 足以在100μl反应中合成2.6μg的DNA。当dNTP终浓度大于50mmol/L时可抑制Taq DNA聚合酶的活性. 4种dNTP的浓度应该相等, 以减少合成中由于某种dNTP的不足出现的错误掺入。  dNTP PCR反应体系- Mg2+ Mg 2+浓度对Taq DNA聚合酶影响很大, 它可影响酶的活性和真实性, Mg 2+浓度过低，会显著降低酶活性; Mg 2+浓度过高又使酶催化非特异性扩增增强。 Mg 2+浓度还影响引物退火和解链温度以及引物二聚体的形成等。 通常Mg 2+ 浓度范围为0.5-2mmol/L, 1.5mM最佳。 PCR反应体系- Taq聚合酶 扩增效率最高, 1000 bp/min 活性5‘-3’ DNA聚合酶活性 强无3‘-5’ DNA外切酶活性 错配率每个循环约1/6000 3‘末端加“A” 能 产物可直接进行“TA”克隆 pfu酶——保真度高 原理: 具3’－5’核酸外切酶活性，即校正功能。效率相对较低, 500 bp/min 3‘末端不加“A”，加A后才可进行TA克隆。 就模板DNA而言, 影响PCR的主要因素是模板的数量和纯度. 一般反应中的模板浓度为 50-100 ng/ml. 模板量过多则可能增加非特异性产物. DNA中的杂质也会影响