人教版高中生物选修一5.3《血红蛋白的提取和分离》课件2共29张PPT.ppt

课题3 血红蛋白的提取和分离 一、课题的目标：通过尝试对血液中血红蛋白的 提取和分离，理解色谱法、电泳法 二、课题重点：凝胶色谱法的原理和方法 三、课题难点：样品的预处理、色谱柱填料的处理 和色谱柱的装填 思考： “课题1--DNA的粗提取与鉴定” 实验理想的材料是什么？ “课题3--血红蛋白的提取和分离”这实验理想的材料又是什么？原因是？ 答：鸡的红细胞具有细胞核，含有DNA，便于进行DNA的提取，哺乳类动物成熟的红细胞无细胞核，结构简单，血红蛋白含量丰富便于提取血红蛋白。 一、基础知识： （一）蛋白质分离原理 （二）蛋白质分离的方法 1）凝胶色谱法：又称分配色谱法 2）电泳法 （三）缓冲液的作用 二、实验操作－－实验步骤 血液组成成分 （1）洗 涤 红 细 胞 （2）释放血红蛋白 （3）分离血红蛋白 （4）透析血红蛋白 1、样品 处理 3、纯化 4、纯度鉴定 2、粗分离 SDS—聚丙烯酰胺凝胶电泳鉴定血红蛋白纯度 凝胶色谱法进行纯化 注意事项 蛋白质提取与分离的依据－－ 蛋白质的物理化学性质差异： 1.分子的形状、大小 2.电荷性质和多少 3.溶解度 4.吸附性质 5.对其他分子亲和力 1.凝胶色谱法 一些微小多孔的球体 （内含许多贯穿的通道，具多孔的凝胶就叫分子筛） 根据相对分子质量的大小分离蛋白质的方法 （2）概念： （1）凝胶 3、原理：当不同的蛋白质通过凝胶时，（ ）的蛋白质容易进入凝胶内部的通道，路程（ ），移动速度（ ），而（ ）的蛋白质无法进入凝胶内部的通道，只能在（ ）移动，路程（ ），移动速度（ ），相对分子质量不同的蛋白质因此得以分离。 相对分子质量较小 较长 较慢 相对分子质量较大 凝胶外部 较短 较快 总结：大分子经过路程短，流动快； 小分子经过路程长，流动慢。 洗脱： 从色谱柱上端不断注入缓冲液，促使蛋白质分子的差速流动。 混合物 上 柱 洗 脱 大分子流动快 小分子流动慢 收 集 大分子 收 集 小分子 4、具体过程 2．凝胶电泳法： 1）原理： 不同蛋白质的带电性质（正电荷或负电荷）、电量、分子形状和大小不同，在电场中受到的作用力大小、方向、阻力不同，导致不同蛋白质在电场中的运动方向和运动速度不同。 2）影响蛋白质分子运动速度的因素 电泳：带电粒子在电场的作用下发生迁移的过程 3）常用电泳方法 琼脂糖凝胶电泳 聚丙酰胺凝胶电泳 SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳 在测定蛋白质分子量时通常用SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳，使用时可选用一组已知分子量的标准蛋白同时进行电泳做对照，根据两者的电泳区带位置，利用相关计算公式算出相对分子量 SDS 带负电荷多的 ，因而掩盖了不同种蛋白质间的电荷的差别，使蛋白质迁移速率仅取决于分子大小。 影响蛋白质分子运动速度的因素 ? 决定 运动方向 决定 运动速率 电荷性质 电荷量 分子形状 分子大小 √ √ √ √ 由弱酸和相应的强碱盐溶解于水中。 如H2CO3/NaHCO3，NaH2PO4/Na2HPO4等 缓冲溶液－－洗脱剂 （1）作用： （2）配制： 抵制外界酸碱对溶液pH的干扰而保持 pH稳定。 （3）在血红蛋白的提取和分离实验中用的缓冲液的原因？ 目的是利用缓冲液模拟细胞内的PH环境， 保证血红蛋白的正常结构和功能。 血液组成成分 阅读思考： 血液由______和________两部分组成。 血细胞中________细胞数量最多，细胞的含量最高的化合物是_____________。 该化合物是由 _____________和____________构成的，其中每个亚基中都含有一个能与O2和CO2结合的______________________基团。 血浆 血细胞 红细胞 血红蛋白 2条α-肽链 2条β-肽链 亚铁血红素 1.洗 涤 红 细 胞 阅读思考：洗涤的目的是什么？ 洗涤的方法是什么？ 洗涤干净的标志是什么？ 血液 10