猪血管内皮细胞中分子伴侣Jiv90基因的克隆与原核表达.docVIP

猪血管内皮细胞中分子伴侣Jiv90基因的克隆与原核表达 动物医学进展.2011,32(7):9-13 ProgressinVeterinaryMedicine 猪血管内皮细胞中分子伴侣Jiv90基因的克隆与原核表达 杨幼聪,郭抗抗,张彦明,李宇立,张倩,程媛媛,张三东,彭维刚 (iNjE农林科技大学动医学院,陕西杨陵712100) 摘要:克隆到猪Jivg0基因,构建原核表达载体并在大肠埃希茵中表达.从猪血管内皮细胞中克隆到 Jiv90基因,将其克隆到pET-32a载体上,构建出重组表达载体,经IPTG诱导表达.结果表明,本试验成功 克隆了大小为693bp的基因,重组质栽体pET-32a-Jiv90所表达的蛋白在大肠埃希茵中以包涵体的形式存 在,表达产物经SDS—PAGE和Westernblot鉴定大小为46ku,与预期结果一致.为进一步研穷该蛋白的功 能及制备抗体奠定了基础. 关键词:Jiv90;pET一32a;原核表达 中图分类号:$852.21;Q786文献标识码:A文章编号:1007—5038(2011)07—0009—05 分子伴侣(molecularchaperone)是一类在进化 上非常保守的蛋白质家族,是协助细胞在正常和胁 迫条件下保持细胞内稳态的重要蛋白组分,参与许 多正常的细胞生理反应过程.它们在反应过程中不 与底物结合,不会成为终产物的组成部分[1],而是通 过与各类蛋白质非特异性结合,催化蛋白质形成特 定的构象,在生物体内起着稳定新生蛋白质,辅助其 他蛋白质正确折叠,组装,转运甚至降解的作用,对 蛋白质功能的发挥具有重要意义L2]. 在复杂的细胞内环境下,蛋白质的折叠是一个 复杂,容易出错的过程,而病毒由于是细胞内寄生 物,在其增殖过程中,需要大量病毒蛋白的翻译,折 叠和运输等修饰过程.随着研究的不断深入,人们 发现分子伴侣在病毒的不同生活周期中都扮演着重 要的角色,如病毒的感染,病毒基因组的复制,基因 的表达,病毒糖蛋白的折叠与成熟,病毒粒子的装配 等过程中起着非常重要的作用[3].病毒利用分子 伴侣,其原因可能是有些病毒在进化过程中为保持 其基因组足够小,因此需要利用伴侣分子帮助其完 成复杂的功能. 许多真核,原核宿主的病毒可直接利用宿主细 胞中的伴侣分子,或借助宿主细胞编码病毒的伴侣 分子以及一些功能蛋白,以完成病毒增殖的许多相 关过程,如流感病毒和水疱性口炎病毒依赖于宿主 的分子伴侣进行血凝素以及病毒糖蛋白的折叠,组 装和运输[5].分子伴侣参与肿瘤细胞增殖,分化,基 质侵染,血管生成,癌细胞转移以及细胞凋亡等 过程. LacknerT等进一步研究发现,在宿主分子 伴侣Jiv90的作用下,能将BVDV的NS2-3蛋白切 割成NS2,NS3蛋白,NS3蛋白与瘟病毒属的复制 的效率密切相关.细胞中过量表达Jiv90能导致非 致细胞病变BVDV的RNA量的增加,且能引起 CPE;将细胞中的Jiv90表达量下调或是将编码该蛋 白的基因敲除,病毒RNA及病毒粒子的量都表现 出明显的下调,且无CPE出现. 2006年Lackner等发现,CSFVNS2蛋白与宿 主细胞中的分子伴侣Jiv90有两个结合区域—— JBPI和JBP1I,两者相互作用后NS2蛋白发挥蛋 白酶活性将N$2-3切割为NS2和NS3[8].2008年 Gallei等人将分子伴侣Jiv9O与非致细胞病变型 (nCP)强毒株CSFVAlfort—p447构建嵌合病毒A1- fort-Jiv90,将后者感染细胞,发现NS3蛋白和病毒 RNA大量增加,同时出现了细胞病变(CPE).这表 明分子伴侣Jiv90能反式调节NS2—3的自我切割作 用. 目前对Jiv90基因的研究只是局限在与病毒的 相互作用和对病毒复制的影响,对Jiv90蛋白本身的 研究报道较少.本试验构建Jiv90基因的原核表达 载体,并对其表达情况进行了研究,以期为下一步制 收稿日期:2011-05—18 基金项目:国家转基因生物新品种培育重大专项一抗病转基因新品种培育(2009ZX08006一O06B);陕西省13115科技 创新工程重大科技专项一猪瘟病毒致病机理与抗病育种研究(2OO9zDK23) 作者简介:扬幼聪(1984一),男,河北邢台人,硕士研究生,主要从事分子病原学与免疫学研究.*通讯作者 1O动物医学进展2011年第32卷第7期(总第217期) 备JivgO单克隆抗体提供基础材料,同时为进一步深 入研究Jiv90蛋白的功能奠定基础. 1材料与方法 1.1材料 1.1.1菌株,质粒和细胞E.coliDH5a,BL21菌 株,原核表达载体pET-32a和猪血管内皮细胞,均由 本西北农林科技大学动物医学院畜禽疫病防治与畜 产品安全实验室保存. 1.1.2主要工具酶及试剂限制性