第九章节 RNA干扰与基因表达.pptVIP

第九章 RNA干扰与基因表达;第一节 RNA干扰及其机制;二、干扰机制 1.RNAi的起始阶段：内源或外源dsRNA导入细胞，在dicer酶作用下切割为siRNA（21-23bp） 2. RNAi的效应阶段： siRNA介导靶mRNA的降解。 3. RNAi循环放大阶段：微量的dsRNA就可以使RNAi效应遍及整个机体。dsRNA切割生成siRNA，siRNA以靶mRNA为模板，合成dsRNA。;三、RNAi的特点 1.RNAi是PTGS机制 2.特异性：只特异降解与之匹配的单个内源基因的mRNA。 3.高效性：体内与体外实验表明，RNAi抑制基因表达具有很高的效率。 ;4.dsRNA长度的局限性： 一般不得短于21bp，长链dsRNA也必须被dicer酶切割为21bp的siRNA。 5.可传播性：细胞之间可以长距离传递。 6.ATP依赖性 7.稳定性dsRNA和 siRNA双链结构，比较稳定 8.快捷性：siRNA转染细胞，48h就能观察到靶基因的抑制作用。;第二节 RNAi与基因沉默;一、转录水平的基因沉默;1.RNAi与甲基化 传统认为RNAi只发生在转录后水平，最近研究发现，siRNA也能在转录水平调控基因表达。 RdDM（RNA directed DNA methylation）：RNA指导的DNA甲基化。 1994年，Wassengger在研究一种病毒感染烟草时发现。;2.RNAi与异染色质的形成 线虫中发现，RNAi来修饰染色质，抑制基因表达。具体来讲，是siRNA修饰组蛋白H3第9为lys残基。 组蛋白乙酰化，不能与DNA结合，基因活化；组蛋白去乙酰化，与DNA结合，基因表达受抑制。 ;3.RNAi与DNA分子消融（elimination） 四膜虫中最早发现，siRAN介导异染色质形成后，DNA分子会发生消融和重组。;;1993年Lee等在一种线虫中发现。 miRNA的特点： 广泛分布，单链，长度21-25bp，较长的miRNA要被dicer切割。 miRNA作用机制： miRNA是编码基因指导合成。包括前体合成、微处理复合体识别和切割、转运、dicer酶切割、形成RISC（RNA-induced silencing complex）、miRNP、与靶mRNA的互补。;3.siRNA与miRNA的区别 表9-1，（做详细介绍）;第三节 RNAi的研究方法;二、siRNA的制备 1.体外制备法：包括化学合成法、体外转录法、dsRNA体外降解法。 2.体内表达：转染DNA模板在体内表达。siRNA载体、siRNA表达框架在细胞中的表达。;3. siRNA的导入 磷酸钙沉淀法、电穿孔法、机械法;第四节 RNA干扰的应用;二、研究信号传导通路 三、基因治疗 抗肿瘤治疗 抗病毒治疗