fitc及gddtpa标记的可活化穿膜肽在人肝内胆管上皮细胞中的作用研究 word格式.docxVIP

FITC 及 Gd-DTPA 标记的可活化穿膜肽在人肝内胆管上皮细胞中的作用研究 中文摘要目的：通过利用可活化穿膜肽的特性将荧光标记物及磁共振对比剂带入人肝内胆管 上皮细胞，借此研究肝内胆管上皮细胞在胆管病中的变化，探讨在肝胆管病中体外监 测胆管上皮细胞变化及药物靶向定位的可行性，为临床上治疗胆管病以新的思路，提 高胆管病的治疗效果。方法：一、 穿膜肽的合成及标记：可活化穿膜肽（EEEEEEEE-PLGLAG-RRRRRRRR-Ahx-k）由 上海淘普生物科技有限公司利用用固相法化学合成，并在其N端分别标记FITC 及Gd-DTPA。二、荧光显微镜分析：培养正常人肝内胆管上皮细胞（human intrahepatic bile duct epithelial cells，hIBDEC），培养成功后分别用含有2μg/ml、5μg/ml、10μg/ml、 15μg/ml、20μg/ml的LPS的培养液培养，培养24h后再将每组分别用25umol?L-1、50umol?L-1、100umol?L-1、150umol?L-1标记有FITC的ACPP(FITC-ACPP)孵育2h，观察 上诉各组细胞及无ACPP孵育有LPS刺激24h有FITC共孵育2h组与无LPS刺激有FITC-ACPP共孵育2h组内的荧光表达情况，选择出LPS的刺激浓度范围及最佳的 FITC-ACPP作用浓度。三、流式细胞仪检测：（1）分别用含有2.5μg/ml、5μg/ml、10μg/ml的LPS培养液 培养hIBDEC72h，再将其与100umol?L-1的FITC-ACPP共孵育2h。（2）用含有5μg/ml 的LPS培养液培养hIBDEC，按24h、48h、72h时间梯度培养后，再将其与100 umol?L-1的FITC-ACPP共孵育4h。（3）用含有5μg/ml的LPS培养液培养hIBDEC72h， 再将其与100umol?L-1的FITC-ACPP按照1h、2h、4h的时间梯度共孵育，采用流式 细胞仪检测上诉各组细胞内的荧光强度值。四、磁共振成像研究：（1）分别用含有2.5μg/ml、5μg/ml、10μg/ml的LPS培养液培养hIBDEC72h，再将其与100umol?L-1的标记有Gd-DTPA的ACPP（Gd-DTPA-ACPP） 共孵育2h。（2）用含有5μg/ml的LPS培养液培养hIBDEC，按24h、48h、72h时间 梯度培养后，再将其与100umol?L-1的Gd-DTPA-ACPP共孵育4h。（3）用含有5μg/ml 的LPS培养液培养hIBDEC72h，再将其与100umol?L-1的Gd-DTPA-ACPP按照1h、2h、 4h的时间梯度共孵育，采用磁共振成像仪检测上诉各组细胞及空白细胞组、无LPS 刺激有Gd-DTPA-ACPP共孵育4h组细胞内的平均信号强度值。并采用视觉评价法分 析各组细胞内的磁共振信号变化特征。五、统计学分析：采用SPSS19.0统计软件进行统计学分析。所有实验结果以均数±标 准差（Mean±SD）表示。组与组间比较采用单因素方差分析，检验水准α=0.05。结果：一、 荧光显微镜检测见无ACPP孵育有LPS刺激24h有FITC共孵育2h组及无LPS刺激有 FITC-ACPP共孵育2h组细胞内均未见荧光反应,其余各组均可见荧光反应。同一 FITC-ACPP浓度孵育及孵育时间、不同LPS刺激浓度的细胞相比，10μg/ml、 5μg/ml、2μg/ml组荧光肉眼观无明显差异。20μg/ml LPS刺激浓度下细胞不 能贴壁，未到24h细胞碎裂死亡，15μg/ml LPS刺激浓度组虽未碎裂死亡，但仅 有少量细胞存活，FITC-ACPP孵育后冲洗细胞爬片时细胞脱离载玻片，故 20μg/ml与15μg/ml LPS刺激浓度组未能进行荧光显微镜拍照；同一LPS刺激浓 度、不同FITC-ACPP浓度孵育的细胞相比，肉眼观25umol?L-1与50umol?L-1组较 100umol?L-1与150umol?L-1弱、100umol?L-1与150umol?L-1组无明显差异，故选择100umol?L-1的FITC-ACPP为实验浓度。二、流式细胞仪检测见：（1）在5μg/ml LPS刺激浓度刺激72h、100umol?L-1的FITC-ACPP 共孵育的条件下，随着FITC-ACPP孵育时间的增加（1h、2h、4h），平均荧光强度 值逐渐增加，并有统计学意义（P0.05）。（2）在5μg/ml LPS刺激浓度刺激、 100umol?L-1的FITC-ACPP共孵育4h的条件下，随着LPS刺激时间的增加（24h、48h、72h），平均荧光强度值逐渐增加，并有统计学意义（P0.05）。（3）在不同浓度 的LPS刺激72h、10