第五章节 海洋微藻的细胞操作.pptVIP

第五章海洋微藻的细胞操作;1.概论;海洋微藻细胞操作的意义;通过原生质体进行细胞操作和遗传饰变的要点概况成为： （1）原生质体的分离 （2）原生质体的培养及再生 （3）细胞融合 （4）把外源遗传物质、细胞器或微生物导入原生质体;海洋微藻细胞操作研究的历史与现状;微藻细胞操作的有关问题;细胞操作的全过程应保持在细胞的正常生理状态，这在再生和增殖阶段更为重要。需要注意的要点是： 1.处理前细胞状态的控制 2.处理过程细胞状态 的控制，特别是外界条件如： 温度、光照、盐度、PH、和处理时间等的控制 3.渗透压调节剂的种类和浓度 4.原生质体膜的稳定性 5、原生质体的纯化方法及纯度 6、不同研究目的的不同原生质体化程度。;5.2海洋微藻的分离和纯化技术;5.2.2 分离方法;2.喷雾技术 相当简捷的技术，可用来分离和纯化采集的藻样。用离心洗涤法洗8~9ml藻样，最后离心一次后，在离心管中留2ml上清液，其余倒掉。将毛细管通过棉塞插到离心管的底部，将离心管固定于滴定台上。将压缩空气通过一滴管吹出并从离心管中的毛细管的顶端通过。离心管中的悬浮液会被吸出并形成细雾。将一灭菌的琼脂培养基平板迅速通过细雾，距离大约为25cm左右。盖好培养皿，至于合适的光照和温度下培养。经几天生长后，可用毛细滴管将没有细菌和真菌污染的单细胞或藻落挑出移入新鲜培养液中。;3.琼脂板技术 将采集的少量藻与已冷却的但未凝固的含有营养物的琼脂培养液混合，搅匀后倒入培养皿，冷却凝固。在适宜条件下经几天培养后，将形成的藻落切下，再移入新鲜培养液中培养。 ;5.2.3 纯化方法;4.过滤技术 膜滤可用来分离丝状体海藻和细菌。 5.纯化程度的检测 经纯化的培养物，应进行检测以确定培养物是否真正逮到了无菌，用一般性培养基做检测在不同温度和光暗条件下进行。;5.3 培养基成分及作用;海水是海藻生长的理想介质，自然海水可以满足孢子萌发和不同藻种的分离等研究的需要，但在多数的培养中，用几种植物培养物如N、P、和Fe等加富海水是必要的。 合成培养基的主要目的是提供简化的和确定的培养基。;在??制培养基的过程中，一个主要的问题是海水培养基高压灭菌时会产生沉淀。 目前，解决这一问题的途径主要有两个： 1.加入某种适宜且无毒的PH缓冲剂和螯合物，同时降低培养基的盐度，特别是钙的浓度。 2.用滤膜过滤的方法灭菌。;用于藻类培养的培养基配方有很多种，每种配方主要适用于一定藻种，这里介绍几种比较常用的。 水生4号和克诺普（Knop）培养液，一般用于绿藻；蓝藻可用朱氏10号或水生105号无氮培养基（后者适于固氮蓝藻）；硅藻可用朱氏10号和水生硅1号培养基；另外还有海产绿藻、硅藻的培养基。常用培养基配方见下表。 ;;以上用水量都是加至1000mL，海藻培养液用海水，如无海水可用淡水1000mL加30克食盐代替。土壤抽出液用菜园土1份和水2份比例混合搅匀，静置，取上清液；海泥抽出液也可用同样比例制备。如配制固体培养基，可在培养液内加入1.5％琼脂。 ;培养基的配制及其原则;一、培养基母液的配制;（三）母液配制的药品与器材 1、药品：配制藻类培养基所需的药品、蒸馏水、0.1mol/L的NaOH，0.1mol/L的HCL 等。 2、器材：各类天平、烧杯、容量瓶、量筒、母液瓶、标签、冰箱等。;（四）母液配制（以MS培养基为例） ;配制MS培养基时母液的计算;二、培养基的配制;三、配制藻类培养基的原则;MS培养基是目前使用最普遍的培养基。其具有较高的无机盐浓度，能够保证组织生长所需的矿质营养还能加速愈伤组织的生长。由于配方中的离子浓度高，在配制、贮存和消毒等过程中，即使有些成分略有出入，也不会影响离子间的平衡。MS固体培养基可用于诱导愈伤组织，也可用于胚、茎段、茎尖及花药的培养，其液体培养基用于细胞悬浮培养时能获得明显的成功。MS培养基的无机养分的数量和比例比较合适，足以满足植物细胞在营养上和生理上的需要。因此，一般情况下，不用再添加氨基酸、酪蛋白水解物、酵母提取物及椰子汁等有机附加成分。和其它培养基的基本成分相比，MS培养基中的硝酸盐、钾和铵的含量高，这是它的显著特点。;5.4 海洋微藻的生长测量和培养技术;5.4.1 培养类型 ;类型;5.4.2 生长测定 ;;2. 细胞计数方法;计数方法： 用酒精擦洗计数板 取一滴藻液滴在盖玻片一侧边缘，使它沿着盖玻片和计数板间的缝隙渗入计数室 计数 1ml细胞数=1个大方格（0.1ul）细胞数×10 ×1000;2)光密度法 原理：分光光度计采用一个可以产生多个波长的光源，通过系列分光