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《婴幼儿配方食品和乳粉 核苷酸的测定》编制说明 引言 　 核苷酸是构成核酸的成分，是由含氮的碱基、核糖或脱氧核糖、磷酸3 种分子连接而成。核苷酸在人体内广泛分布，具有多种生物学功能：核苷酸是构成核酸的基本单位，这是其最主要功能。参与和生理调节。组成辅酶核苷酸婴儿的营养素，对婴儿的生长发育有重要的作用。全国标准化技术委员会美赞臣（）有限公司人体对核苷酸的需求是有一定限度的，并非越多越好。美赞臣（广州）有限公司 样品的处理方法的研究 样品的处理主要考虑的是既能将样品中的蛋白质分离出去，又能将核苷酸无损失的提取出来。为此我们将样品用水溶解，通过超声波振荡后采用3种样品处理方式来沉淀蛋白质：10%乙酸、调pH值及0.33mol/L的高氯酸。10%乙酸沉淀蛋白和高氯酸沉淀蛋白质的方法是将充分振荡溶解的样品转入50mL容量瓶中，加入5mL10%乙酸或0.33mol/L的高氯酸溶液，定容，充分混匀后用滤纸过滤；调pH法沉淀蛋白质的方法是先用稀盐酸溶液将充分振荡溶解的样品溶液的pH调至1.7，静止1min后再用氢氧化钠调pH到4.5，转入50ml容量瓶中定容，混匀，用滤纸过滤。上述滤液通过0.45μm的滤膜过滤后上机测定。通过对测定色谱图进行分析后发现：上述3种处理方式对色谱图中杂质峰的数量和色谱峰形及分离度都有有一定的影响：调pH沉淀蛋白质的试液杂质峰要多于用乙酸沉淀蛋白质的方法。使用高氯酸沉淀蛋白和乙酸沉淀蛋白效果相近，但用乙酸沉淀时色谱峰形最好，而且方便。根据上述处理样品方法的比较，确定采用10%乙酸沉淀蛋白质的样品处理方法。 5.4 色谱柱及条件的选择 5.4.1 色谱柱的选择： 色谱柱性能是待测物能否达到理想的分离度、方法成功的关键之一。由于核苷酸为离子型化合物，采用离子对色谱进行各组分的分离可能会得到理想的结果。 在色谱柱的选择上，我们先后采用了AichromBond-AQ C18柱、SUPELCOSIL LC-18-T C18柱和氨基柱waters三种色谱柱进行实验。结果发现：使用氨基柱时，GMP和IMP完全重叠在一起，没有分开，所有组分在10min左右全部流出；使用AichromBond-AQ C18柱时，由于流动相的细微变化，其中GMP和IMP有时重叠在一起，有时分离度较差，较难分离；而SUPELCOSIL LC-18-T可以使五种核苷酸都得到较好的分离。SUPELCOSIL LC-18-T柱添料的硅表面经过特殊的处理，与普通的C18柱相比，它可以减少硅烷醇和核苷酸之间的相互作用，提高分析的灵敏度，因此我们选用SUPELCOSIL LC-18-T柱进行测定。 5.4.2 流动相的选择 我们主要对流动相进行了优化，即离子对试剂的浓度、流动相pH 值和甲醇浓度进行优化。 5.4.2.1离子对试剂的浓度 我们选用离子对试剂四丁基硫酸氢铵的浓度分别为1.30mmol/L、1.40mmol/L、1.50mmol/L、1.70mmol/L、1.75mmol/L、和2.0mmol/L。由试验结果可以看出离子对试剂浓度变化对核苷酸的出峰顺序、分离效果及峰形影响很大：当四丁基硫酸氢铵浓度为1.40mmol/L时，分离效果最好，基线分离，峰形对称，且样品中的核苷酸与杂质峰完全分开，色谱峰的顺序为CMP、AMP 、UMP、GMP 和IMP。因此我们选用离子对试剂的浓度为1.40mmol/L。 5.4.2.2流动相 pH值的选择 考虑到核苷酸的水溶液在酸性环境中比较稳定，选择调节流动相的pH值为酸性。对pH值在4.5～6.0之间进行实验，经过采用不同pH值的试验证明：pH为5.0时，核苷酸的五个色谱峰能够完全分开，灵敏度比较高，最终确定选择pH为5.0。实验表明pH值对色谱峰的分离有很大的影响，因此调流动相pH时，一定要精确。 5.4.2.3甲醇体积分数 在确定离子对试剂的浓度（1.40mmol/L）和流动相的pH值（5.0）后，又对含离子对试剂的缓冲盐溶液与甲醇的体积分数比为100：0、100：1、100：2.5、100：4、100：5和100：10的流动相进行实验。实验表明：加入甲醇的体积对五个组分峰的保留时间影响较大，而且对五个组分峰影响的程度不一样，并直接影响出峰顺序及分离度。结果表明含离子对试剂的缓冲盐溶液与甲醇的体积分数比为100：4的流动相效果更好。经过实验最终决定采用含离子对试剂的缓冲盐溶液与甲醇的体积分数比为100：4的溶液作为流动相。 标准及奶粉核苷酸色谱图 图1 五种标样色谱图 图2 样品与样品加标样色谱图 5.5 标准曲线的绘制 将核苷酸标准溶液稀释成不同浓度的标准系列，分别用不同浓度的标准溶液进样，以浓度为横坐标，峰高均值为纵坐标，绘制标准工作曲线，通过回归计算求得回归方程和相关系数，可见在一定浓度范围内浓度与峰