基因克隆载体小结.pptVIP

3.1质粒克隆载体 3.2 病毒克隆载体 3.2.1 λ噬菌体载体 3.2.2 cosmid克隆载体 3.2.3 M13噬菌体克隆载体 3.2.4 CaMV克隆载体 3.2.5 烟草花叶病毒（TMV）克隆载体 3.2.6 SV40克隆载体 3.3 染色体定位整合克隆载体 3.4 人造染色体载体：细菌人工染色体；酵母人工染色体 特殊用途克隆载体 质粒克隆载体的构建 选择合适的出发质粒 正确获得构建质粒克隆载体的元件 组装合适的选择标记基因 选用合适的启动子 构建过程简单 大肠杆菌质粒克隆载体pBR322 及其衍生物质粒克隆载体的构建 pBR322质粒的结构特征： 大小：4.3kb 具有ColE1拷贝复制子 选择标记：Amp，Tet 24种限制性核酸内切酶单一位点； BamHI等导致Tet插入失活； PstI等导致Amp插入失活。 pUC质粒载体的结构特点 pBR322的复制起点 Amp标记 大肠杆菌β-半乳糖苷酶基因LacZ的启动子及编码α-肽链的DNA序列——LacZ’ 在LacZ’的5‘端有1段多克隆位点（MCS）区段。 农杆菌Ti质粒克隆载体的构建 Ti质粒（Tumor inducing plasmid）——存在于植物的土壤农杆菌中，诱发植物产生冠樱瘤的质粒。 冠瘿瘤(crown gall)是一种植物肿瘤,一堆未分化的组织团 分为4种类型： 章鱼碱型(octopine) 胭脂碱型(nopaline) 农杆碱型(agropine) 农杆菌素碱型（琥珀碱型,succinamopine） 1.Ti质粒的结构和特性 Ti质粒是根癌农杆菌染色体以外的遗传物质 双链闭合环型DNA 200-250kb 结构分为4个功能区： T-DNA区 Vir区 Con区 Ori区 双元中间克隆载体—微型质粒（mini-Ti plasmid） 含有T-DNA左右边界 含有广谱质粒的复制起始位点（oriV）和转移起始位点（oriT） 在大肠杆菌中多拷贝复制 病毒（噬菌体）克隆载体 病毒克隆载体 噬菌体克隆载体 λ噬菌体克隆载体 与构建克隆载体相关的λ噬菌体性质 λ DNA： ——在噬菌体中是线状DNA分子，进入寄主细胞后呈环状DNA分子。 ——长48kb。 ——左右两端各有12bp组成的彼此完全互补的粘性末端。形成cos位点。 ——包括61个基因，其中1/2参与了噬菌体生命周期，是必要基因，另1/2属于不必要基因，用于基因工程操作。 选用λ噬菌体作为构建克隆载体材料的依据 cosmid克隆载体 ——cosmid = cos site-carrying plasmid 构建cosmid克隆载体的策略 具有噬菌体载体的高转导性能：保留cos位点以及包装的相关基因。 结合质粒载体的自我复制性能，改变质粒载体携带外源DNA小的缺点。 cosmid克隆载体的特征 环型DNA分子，大小不超过36kb。 具有质粒性质，可以转化大肠杆菌，并自我复制，有RE切点。 有cos位点，提供包装的条件。具有λ噬菌体的特性。在克隆了合适长度的外源DNA，并在体外被包装成噬菌体颗粒之后，可以高效转染对λ噬菌体敏感的大肠杆菌寄主细胞。进入寄主细胞之后的粘粒DNA分子，能按照λ噬菌体DNA同样的方式环化。 承载大的外源DNA片段。见教材113页。 M13噬菌体克隆载体 M13 DNA 环型单链DNA，（+） 长6.4kb， 分10区和1间隔区 间隔区内可以插入外原DNA。 定位整合克隆载体的几种模式 内源平台双交换置换克隆载体 外源平台双交换置换克隆载体 内源平台双交换插入克隆载体 内源平台单交换插入克隆载体 定位整合克隆载体 植物染色体定位整合克隆载体 动物染色体定位整合克隆载体 思考题 一.概念 严紧型质粒；松弛型质粒；质粒的不亲和性；克隆载体；表达载体；穿梭载体； α-互补；冠瘿碱； T-DNA ；双元中间克隆载体；中间质粒克隆载体；COS位点；整合平台；定位整合克隆载体 二.问答题 1.基因克隆载体的条件？ 2. pUC质粒载体的优点？ 3.农杆菌Ti质粒如何将外源DNA整合到植物染色体上？ 4.如何建立重组λDNA分子体外包装系统？ 5. 为什么M13载体是成对出现的？ 大鼠定位整合克隆载体 整合平台——大鼠乳清酸蛋白WAP启动子的调控序列 + 3‘UTR序列 (1) BAC是环状 DNA 分子，包括 MCS 抗生素抗性基因 复制子：来源于大肠杆菌 F 因子 RepE：调节复制复合物在复制位点处组装 par