分子生物学 第五-六章 分子生物学研究方法-2010-11-8修改.pptVIP

（1）什么是RNAi？ □ RNAi（RNA interference）是指利用双链小RNA高效、特异性降解细胞内同源mRNA，从而阻断体内靶基因表达，使细胞出现靶基因缺失表型的方法。 □ 一种转录后水平的基因沉默 □ 生物体内普遍存在 □ 抵御外在感染的重要保护机制 （2）预备知识： □ dsRNA：双链RNA。 □ Dicer：属于RNaseⅢ 家族，是dsRNA的特异性核酸内切酶 □ siRNA：small interfering RNA ，RNAi的关键效应分子，21-23个nt大小的双链RNA □ RISC：RNA-inducing silencing complex，具有核酸内切、外切以及解旋酶活性 □ RdRP：RNA-dependent RNA polymerases，是RNAi的调节因子，使RNAi可以在生物体内传递 （3）RNAi引发的基因沉默机制 □ RNAi是siRNA介导的转录后水平的基因沉默 □ RNAi作用针对的是靶基因的外显子序列 □高特异性，只针对同源靶向mRNA □高效性，极低浓度的siRNA就能完全抑制基因表达 □ RNAi作用具有可传递性 （4）RNAi的分子生物学特性 （5）应用 □基因功能研究 □基因治疗 基因缺陷 病毒感染 肿瘤疾病 □其它应用 植物代谢 细胞信号传导通路 （6）小结 □存在的问题： RNAi作用太过精确 RNAi产生原因未知，作用机制不确知 如何使外源RNA进入哺乳动物体内 如何将RNAi技术运用到临床试验 □前景与展望 RNAi是调控基因表达开关的“士兵” 可以作为一种简单、有效的代替基因敲除的遗传工具。 在未来的基因治疗中发挥作用 对整个生物理论产生巨大而深远的影响 谨慎利用 3 基因敲除 基因敲除（ gene knock-out ）技术：针对一个序列已知但功能未知的基因，从DNA水平设计实验，彻底破坏该基因的功能或消除其表达机制，从而推测该基因的生物学功能。 例如，利用基因打靶技术，用无功能的外源基因转入细胞与基因组中同源序列进行同源重组，把具有功能的同源序列置换出来，造成功能基因的缺失或失活。 ▲高等动物基因敲除的技术路线：构建重组基因载体，用电穿孔、显微注射等方法把重组DNA导入胚胎干细胞纯系中，使外源DNA与胚胎干细胞基因组中相应部分发生同源重组，将重组载体中的DNA序列整合到内源基因组中得以表达。 ▲植物基因敲除技术：T-DNA插入失活技术，即利用根癌农杆菌T-DNA介导转化，将一段带有报告基因的DNA序列标签整合到基因组DNA上，如果这段DNA插入到目的基因内部或附近，就会影响该基因表达，从而使该基因’失活“。 4 基因芯片(gene chip) 定义： 基因芯片（Gene Chip）,又称DNA微阵列(DNA microarray)技术，把大量已知或未知序列的DNA片段点在尼龙膜或玻璃片上，再经过物理吸附作用达到固定化。将芯片与待测研究的cDNA或其他样品杂交，经过计算机扫描和数据处理，便可以观察到成千上万个基因在不同组织或同一组织不同发育时期或不同生理条件下的表达模式。 其应用： 基因芯片技术在分子免疫学中的应用； 基因芯片技术在基因表达谱测定中的应用； 基因芯片技术在突变检测及多态性分析方面的应用； 基因芯片技术在基因组文库作图中的应用； 基因芯片技术与生物传感器的结合应用。 5 凝胶滞缓实验(electrophoretic mobility shift assay, EMSA) 凝胶滞缓实验 ，又称DNA迁移率变化试验,是体外分析DNA与蛋白质相互作用的一种特殊的凝胶电泳技术。其基本原理：蛋白质与DNA结合后将大大增加相对分子质量，而凝胶电泳中DNA朝正极移动的距离与其相对分子质量的对数成正比。 6、RACE技术（rapid amplification of cDNA ends， cDNA末端的快速扩增) RACE技术： 是指利用PCR技术在已知部分cDNA序列的基础上特异性克隆其5 ’端或3’端缺失序列的方法。 其主要步骤： （参见书P183-184） 7、SNP的理论与应用 (1)概念： SNP（single nucleotide polymorphism,单核苷酸多态性)是指基因组DNA序列中由于单个核苷酸（A,T、C和G）的突变而引起的多态性。 单倍型（haplotype)：是指位于染色体上某一区域的一组相关联的SNP等位位点。 基因分型(genotyping)：是指利用数据库中已有的SN