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DNA操作技术主要有：切割、连接、缩短、加长、转录成RNA，或者合成新的DNA，化学修饰、或者去掉特殊的化学基团。 学习内容： DNA操作酶 核酸酶 连接酶 聚合酶 DNA修饰酶 限制性内切酶 分类和命名 酶切体系、反应条件、结果鉴定 定位酶切位点 连接 1.1 核酸酶 1.1 核酸酶 1.1 核酸酶 1.1 核酸酶 1.1 核酸酶 RNase H（E. coli） 降解RNA:DNA杂交分子中的RNA。 1.2 连接酶 1.2 连接酶 T4-DNA连接酶 连接粘性末端、平端 修复双链DNA或RNA-DNA杂交双链上的缺口。 E. coli DNA连接酶 连接粘性末端（主要用于cDNA第二链的合成） 1.3 聚合酶 DNA聚合酶I 5’-3’聚合酶活性 3’-5’外切酶活性 5’-3’外切酶活性 核酸内切酶活性 可以被枯草杆菌蛋白酶水解成：Klenow片段和N端具5’-3’外切酶活性的分子。 1.3 聚合酶 1.3 聚合酶 1.3 聚合酶 T4 DNA聚合酶 与Klenow酶相似，外切酶活性更高。体外诱变反应中效率很高。 T7 DNA聚合酶 测序酶 Taq DNA聚合酶 1.3 聚合酶 逆转录酶：将mRNA转录成cDNA AMV逆转录酶（鸟类成髓细胞性白血病病毒） M-MLV逆转录酶（Moloney鼠白血病病毒） 1.3 聚合酶 两种逆转录酶的区别 肽链的组成 禽酶2条肽链，具聚合酶和很强的RNase H活性 鼠酶1条，较弱的RNase H活性 反应的最适温度 禽酶42°C，二级结构丰富RNA，禽酶效率高 反应的最适pH值 禽酶pH 8.3 鼠酶pH 7.6 1.4 DNA修饰酶 碱性磷酸酯酶（来自于大肠杆菌或小牛肠道）可以去掉DNA分子的5‘端的磷酸基团。 polynucleotide kinase: 来自于T4侵染的大肠杆菌，在5’端增加磷酸基团。 末端脱氧核苷酸转移酶（terminal deoxynucleotidyl tansferase） 来自于小牛胸腺组织，在DNA分子的3‘端增加一个或多个脱氧核苷酸。 甲基化酶与限制性内切酶具有相同的识别序列。 1.4 DNA修饰酶 碱性磷酸酶（BAP, CIP） 作用于载体的5’端，提高重组效率 作用于外源DNA的5’端，防止自连 1.4 DNA修饰酶 T4--多核苷酸激酶（T4-PNP） 将γ-磷酸转移到DNA或RNA的5’端 放射性标记DNA的5’端 连接反应中，使缺少5’端磷酸的DNA片段和接头磷酸化 1.4 DNA修饰酶 末端脱氧核苷酰转移酶（TDT） 3’端突出的双链DNA，Mg2+ 平端或3‘凹端的低物，Co2+ 1.5 拓扑异构酶 在共价闭合双链上通过磷酸二酯键的短暂断裂和重新连接解开超螺旋 2 限制性内切酶 2 限制性内切酶 Restriction Endonuclease催化双链DNA分子的断裂，产生限制性片段。 不同来源的DNA具有不同的酶切位点以及不同的位点排列顺序，因此各种生物的DNA均呈现特征性的限制性酶切图谱。 在生物分类、基因定位、疾病诊断、刑事诊断以及基因重组领域起重要作用，并誉为“分子手术刀”。 限制-修饰现象 2.1 限制性内切酶的发现 限制-修饰现象 1968年Smith等人从流感嗜血杆菌株中分离出两个类内切酶，HindII和HindIII，为基因工程技术的诞生奠定基础。 2.2 限制性内切酶分类 限制性核酸内切酶可分为三大类： I类 II类* III类 I 类限制性内切酶 能识别专一的核苷酸顺序，并在识别点附近的一些核苷酸上切割,但是切割的核苷酸顺序是随机的。 代表EcoB、EcoK (II型)限制性内切酶 能识别专一的核苷酸顺序，并在该顺序内的固定位置上切割双链。 II 型限制性内切酶的识别顺序是一个回文对称顺序(palindrome)，即有一个中心对称轴，从这个轴朝二个方向“读”都完全相同。 III型限制性内切酶 有专一的识别顺序，但不是对称的回文顺序,在识别顺序旁边几个核苷酸对的固定位置上切割双链。 2.3 限制性内切酶的命名原则 命名原则：取属名的第一个字母大写，取种名的前两个字母小写，构成基本名称。该种中发现的不同的酶按照顺序编号I, II, III等。如存在变种和品系，取变种或品系的一个字母。若酶存在于质粒上，则需大写字母表示非染色体遗传因子。 Pvu I识别CGATCG，Pvu II识别CAGCTG, 都来自于Proteus vulgaris。 HindIII是在Haemophilus influenzae d株中发现的第三种酶。 EcoRI表示基因位于Escherichia coli中的抗药性R质粒上。