denv2ngc株诱导huvec凋亡及对fasfasl表达水平的影响word格式论文.docxVIP

1.前言登革病毒(Denguevirus，DENV)是黄病毒科的单股正链RNA病毒，有4种血清型（DENV-1～DENV-2），可以引起登革热(Classicaldenguefever，DF)和登革出血热(Dengue hemorrhagic fever, DHF)和登革休克综合征(Dengue shock syndrome，DSS)[1-2]，WHO已将DHF／DSS、肝炎、疟疾、结核列为全球流行最严重的传染病[3-4]。近年来全球DF的流行情况呈不断上升趋势，广泛分布于100多个国家和地区，估计有25亿人处于被感染的威胁中,约1亿人被感染，其中50万人发生DHF、DSS[5-6]。有报道认为，DENV的直接作用以及DENV感染引起的免疫病理损伤参与了病情的发生发展[7-9] ，越来越多的证据表明DENV感染诱导宿主细胞凋亡在DHF／DSS中发挥重要的作用[10-12]，。DHF和DSS患者的临床表现主要为血管通透性增高、血浆渗漏和低血容量性休克，提示其发病机制与止血缺陷或血管损伤相关[13-14]。诸多研究证明DENV可以通过直接和间接途径诱导血管内皮细胞（Vesselendothelial cells，VECs）活化[15]、损伤、坏死和凋亡,表明VECs结构和功能的改变是DHF/DSS 的发病过程中极其重要的病理因素之一。VECs凋亡可以引发微血管一系列病变，甚至影响到微血管周围组织细胞。因此认为，VECs的凋亡是构成微循环障碍发生发展的重要环节。正确理解VECs凋亡发生发展的规律，对认识DENV感染后血管损伤的确切机制有重要意义。细胞凋亡（Apoptosis）是受基因调控的细胞程序性死亡，不仅能在生理情况下发生，在病理状态下也能被一些细胞因子和化学药物诱导而产生[16-17]。凋亡活化途径大致分为三种：外源性途径（死亡受体途径）是由细胞表面的死亡受体如Fas启动，导致caspase-8的切割活化；内源性途径（线粒体途径）是由线粒体细胞色素C的释放启动，导致caspase-9的切割活化；第三种途径是内质网途径，内质网应激导致caspase-12被切割活化，继之激活caspase-9[18]。以上三种途径汇聚到共同的末端通路，即活化的caspase-8，9，12均募集caspase-3[19]，这些通路彼此交织,构成十分复杂的细胞凋亡调控网络。死亡受体(Deathreceptor，DR)途径是DR通过其胞外区与其相应配体结合, 胞内部分募集胞质中与DR相关的接头分子,并通过接头分子进一步募集和活化下游功能分子完成凋亡信号的转导和执行的过程[20]。在哺乳动物细胞表面至少有8 种DR，即Fas（CD95/Apol）、TNFR1（Tumornecrosisfactorreceptor1）、TNFR2、DR4、DR3、DR5、DCR1和DCR2，均属TNF-α受体家族成员。其中TRAIL在对DENV的抗病毒应答中有重要作用，是一个新的抗DENV蛋白[21]，登革病毒感染诱导肝细胞凋亡的实验也证明TRAIL／TRAILR是一对重要的凋亡媒介分子[22]；TNFR/TNF-α也参与细胞凋亡途径的调控；TNF-α可以增强DENV诱导VECs凋亡的作用[23]，而Fas/FasL（Fas Ligand）更是近年来的研究热点。Fas分子主要以膜受体形式存在，无谱系特异性，广泛分布于各类组织细胞表面，包括胸腺细胞、外周活化T、B淋巴细胞、自然杀伤细胞、单核细胞、成纤维细胞、内皮细胞和上皮细胞等[24-25]。FasL的表达则比较局限，生理条件下在免疫豁免组织，如眼前房、大脑、睾丸和胎盘等组织中有一定水平的表达，NK细胞、LAK细胞等免疫细胞及肿瘤表面也存在FasL。其他细胞，如B细胞、巨噬细胞、成纤维细胞、内皮细胞和胸腺细胞正常情况下不表达FasL，但可在一些刺激因素下被诱导表达。Fas与FasL结合可导致携带Fas的细胞发生凋亡[26-27]，由Fas/Fasl介导的细胞凋亡在脉管系统生理或病理的细胞更新过程中发挥了重要作用[27]。近年来，有研究报道发现人脐静脉内皮细胞（Humanumbilicalvein endothelialcells，HUVECs）易被DEN感染[27-29]，在HUVECs膜表面有Fas的天然表达，而且部分死亡受体的配体能够增强DEN诱导HUVECs的凋亡[30-32]。为了解DEN 感染后VECs损伤的确切机制，本实验利用DEN-2感染HUVEC，通过动态分析感染状态下HUVEC凋亡率、膜表面Fas/FasL表达的变化，进一步揭示DEN感染致宿主细胞凋亡的分子机制，为研究DHF／DSS的发病机制提供科学依据。2．实验材料2.1登革2型病毒NGC株：本室常规液氮保存。2.2 细胞株：人脐静脉内皮细胞（HUVE