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DENV-2作用HUVEC后对细胞凋亡、周期以及基因表达的影响[摘要]专业：免疫学研究生：马静导师：左丽教授目的研究登革2型病毒（Dengue Virus type 2）DENV-2作用原代脐带静脉内皮细胞（Human umbilical vein endothelial cell，HUVEC）后，病毒感染率、细胞周期、细胞凋亡情况，并利用基因芯片检测内皮细胞被病毒作用前后表达差异明显的基因，为研究DENV-2直接作用血管内皮细胞后对细胞的影响提供进一步的实验依据。方法利用C6/36细胞扩增DENV-2，RT-PCR实验和测序鉴定病毒；病毒蚀斑实验滴定DENV-2，设定病毒感染剂量均为MOI =10用于下游实验；对分离培养的原代HUVEC做胞内Ⅷ因子检测以及细胞表面CD31分子的表达检测，鉴定HUVEC纯度；用实时荧光定量PCR检测DENV-2作用原代HUVEC不同时间点（12、24h、48h、72h），其胞内DENV-2NS1 基因、E基因mRNA水平表达的变化；同时利用流式细胞仪检测各个时间点细胞周期，细胞凋亡情况以及病毒感染率情况，ELISA法检测培养上清NS1蛋白表达情况，再通过基因芯片的方法检测DENV-2作用后原代HUVEC发生改变的基因。结果.细胞贴壁呈梭型，生长良好，轮廓清晰，符合HUVEC生长特点；免疫组化法检测HUVEC Ⅷ因子的高表达,利用流式细胞仪可检测到HUVEC表面CD31分子表达高达98.56%，证实此为HUVEC。.扩增后的病毒测序结果与GENE BANK比对.病毒噬斑结果为1.4×108PFU/ml.实时荧光定量PCR法检测DENV-2作用HUVEC后，不同时间点胞内DENV-2NS1、E基因mRNA的表达，发现两者均在24h到达高峰，48h和72h依次降低。与12h 相比，E基因的表达倍数依次为65.30、29.40、8.69（24、48、72h）；而NS1 基5.流式细胞仪检测DENV-2作用原代HUVEC凋亡，发现各时间点细胞凋亡无明显差异，P＞0.05；细胞周期G1期、S期以及G2期，各组比较下来，P＞0.05，无明显差异。以BHK细胞做阳性对照，检测各个时间点病毒在原代HUVEC的感染率，即使在感染72h后，病毒的感染率也低于15%6. 与灭活病毒组相比，DENV-2作用原代HUVEC不同时间点，，感染组上清NS1 各个时间点均无明显差异，P＞0.05，无统计学差异。7.基因芯片检测发现DENV作用HUVEC后，可引起IL-6、C3、SOS、CXCL9、IFN- β等基因明显上调。结论.即使在高病毒剂量（MOI=10）条件下，原代HUVEC仍然没有明显的凋亡发生，细胞周期也未发现明显增殖，推测DENV感染机体导致血管渗漏并非是病毒直接作用血管内皮细胞引起的。.基因芯片检测在病毒作用后，内皮细胞IFN-β、C3、CSF-3、CXCL-9等基因上调，推测内皮细胞在DENV感染机体时，主要发挥其免疫调节功能，调控机体免疫应答发生和发展。关键词DV-2HUVEC凋亡周期基因表达1.前言登革病毒(Denguevirus，DENV)属于黄病毒科黄病毒属，有4种血清型，可引起登革热(Classical dengue fever，DF)、登革出血热(Dengue hemorrhagic fever,DHF)和登革休克综合征(Dengueshocksyndrome，DSS)[1]。全球每年估计约有5千万-1亿人感染DENV,有超过50万人出现DHF/DSS[2]。在我国也出现不同程度DF、DHF流行[3]。DENV感染已成为分布广、发病率高、危害较大的虫媒病毒性疾病，成为全球性重要的公共卫生问题[4]。DHF/DSS的临床表现主要为血管通透性增加、血管内皮肿胀、血小板减少、血浆渗漏，严重者可引起休克甚至死亡[5]。血管是人体的重要器官，整个血管的内表面是由一层扁平的薄层的内皮细胞所覆盖。血管内皮细胞(VascularEndothelialCells,VECs)可以通过多条途径参与血压调节、凝血、纤溶、炎性细胞的粘附和迁移，还可在血管形成等生理、病理方面发挥重要的作用[6]。这类细胞在静止的状态下表达MHCI 、II类分子，可作为抗原递呈细胞参与免疫应答[7]。已有数据显示VECs的活化能够调节血浆渗漏[8,9]。目前DENV感染所引起的血管内皮细胞功能紊乱导致血浆渗漏的病理机制仍然还不完全清楚[6]。对于病毒引起的血管渗漏的研究主要分为两方面：一方面认为DENV感染所引起的血\管渗漏是多个因素共同作用间接导致的。病毒感染机体后，既可促进内皮细胞释放趋化因子和炎症因子，导致血管通透性增加，出现水肿，炎症等情况；亦可激活补体，产生C3a、C5a等活性片段，促进肥大细胞脱颗粒释放组胺，前列腺素D2等生物活性