df1细胞分泌的外源体exosomes在alvj免疫抑制中的作用word格式论文.docxVIP

中文摘要J亚群禽白血病病毒（AvianLeukosisVirusSubgroupJ，ALV-J）是禽白血病/肉瘤病毒群的一个新亚群，是由英国人Payne于1991首次报道，其主要引起肉种鸡的髓细胞瘤（Myelcytomatosis，ML）。近年来ALV-J在世界范围内迅速传播，尤其是在1997-1998年对世界养禽业造成了毁灭性的打击。ALV-J是由内源性和外源性禽白血病病毒（AvianLeukosisVirus，ALV）重组而来，自发现以来给养禽业造成了巨大的经济损失。ALV-J除可导致ML并引起感染鸡群死亡外，更值得我们注意的是它的免疫抑制作用，这也是绝大数感染鸡群的主要表现形式，由于ALV-J的感染，鸡群的生产性能大为降低，对疫苗的免疫应答水平降低，导致继发感染其它疾病，引起更重大经济损失。因此，对ALV-J造成免疫抑制的机制及其相关影响因素的研究，对进一步ALV-J 的防控研究具有重要意义。自1987年Johnstone等人发现网织红细胞向成熟红细胞转变过程中释放一种名为外源体（Exosome）的微囊泡之后，Exosome已被越来越多的人进行研究。Exosome来源于细胞内吞途径中的多囊体（Multivesicularbody，MVB），它除了可由网织红细胞分泌之外，还可由诸如各种血细胞、上皮细胞、神经细胞、肿瘤细胞（如黑色素瘤、肺癌、间皮瘤、乳腺癌、卵巢癌、白血病细胞）等多种细胞分泌。近几年，研究发现Exosomes的分泌与反转录病毒出芽之间存在一定的联系，例如人巨细胞病毒(HCMV)蛋白US28主要存在于MVB中，通过HCMV病毒装配与病毒包膜组合在一起；HIV-1出芽依赖Tsg101(一种在MVB形成过程中很重要的蛋白)。反转录病毒在浆膜向外出芽方式与MVB向内出芽一样，都是胞膜包裹胞质内陷，这样反转录病毒似乎与经修饰的MVB内囊泡(比如Exosome)一样，有可能通过MVB与浆膜融合释放到细胞外环境。于是，我们推测病毒感染细胞分泌的Exosome可能携带了某些病毒蛋白，在细胞信号转导中传递了病毒的组成成分，造成细胞对病毒识别的丧失，从而使病毒能够顺利的在细胞内复制及传播。本研究以ALV-J为模式病毒，研究其感染细胞分泌的Exosome在免疫抑制中的作用。采用分级离心和密度梯度离心的方法，从ALV-J感染DF-1细胞及正常DF-1细胞培养基中提取Exosomes，利用电镜技术和免疫印迹分析对其进行鉴定。结果显示，从DF-1细胞培养基中提取的Exosomes主要分布在1.13-1.21g/ml密度层之间，平均直径在30-100nm之间，呈杯状，这与相关报道关于其它细胞分泌的Exosomes特征一致。分别提取等量两种细胞上清液，经BCA蛋白定量后发现ALV-J感染Exosome浓度为正常Exosome浓度的63倍，表明ALV-J感染对Exosome的分泌有重要影响。利用免疫印迹方法，分析DF-1细胞释放ALV-J与其分泌Exosomes之间的关系。结果显示，从正常DF-1细胞和接种ALV-J的DF-1细胞系培养基中提取的Exosomes蛋白组成复杂，蛋白分子量在20-200kD之间，两种Exosome成分之间有相同之处，但也存在差异；Hsp70等标志性蛋白存在于所提取的Exosomes上；用兔抗ALV-JGP85多克隆抗体可以检测到ALV-J感染DF-1细胞Exosome出现阳性条带，条带分子量大小为70kD左右，而DF-1细胞上清液中提取的Exosome检测不到条带，表明DF-1细胞分泌的Exosome携带了病毒的SU蛋白或SU蛋白的一部分；ISU片段是TM内高度保守的免疫抑制序列，具有免疫抑制作用，能够抑制淋巴细胞的分化，用兔抗ISU 肽多克隆抗体正常DF-1细胞Exosome和ALV-J感染DF-1细胞来源的Exosome均可在74kD左右出现阳性条带，表明TM蛋白ISU区域或能与ISU多肽结合的物质也包含在Exosome的囊泡内，而这种物质是正常DF-1细胞分泌的，ALV-J感染细胞后并不影响它的生成。上述结果表明，正常DF-1细胞和ALV-J感染DF-1细胞系可以分泌Exosomes，ALV-J感染DF-1细胞释放的Exosome携带有ALV-J病毒的表面蛋白和跨膜蛋白高度保守区域，根据Exosome自身所具有的远程信号传导功能，我们确定Exosome在ALV-J所造成的免疫抑制过程中起信号传递作用。关键词：DF-1 细胞，ALV-J，Exosomes，相互作用，免疫抑制AbstractAvianleukosisvirussubgroupJ(ALV-J)wasfirstreportedasanewsubgroupofALVbyPaynein1991intheUnitedKingdom,inducedav