甲基化作用调节mir-200b表达及对胃腺癌细胞增殖 侵袭能力的影响-methylation regulates mir - 200b expression and its influence on proliferation and invasiveness of gastric cancer cells.docxVIP

学位论文原创性声明本人郑重声明：所呈交的论文是我个人在导师指导下独立进行研究工作取 得的研究成果。除了文中特别加以标注引用的内容和致谢的地方外，论文中不 包含任何其他个人或集体已经发表或撰写过的研究成果，与我一同工作的同志 对本研究所做的任何贡献均已在论文中作了明确的说明并表示了谢意。学位论文作者签名：日期：年月日学位论文版权使用授权书本学位论文作者完全了解天津医科大学有关保留、使用学位论文的规定， 即：学校有权将学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行检索，并采用 影印、缩印或扫描等复制手段保存、汇编以供查阅和借阅。同意学校向国家有 关部门或机构送交论文，并编入有关数据库。本论文属于保密，在年解密后适用本授权书。不保密 ?。（请在相对应的方框内打―√‖ ）学位论文作者签名：日期：年月日导 师 签 名：日期：年月日中文摘要目的：基因异常甲基化在多种疾病发生发展机制中有着重要的作用。本研 究旨在探讨 miR-200b 发生甲基化程度不同及其表达量的差异对于胃癌细胞 MGC-803、BGC-823 增殖、侵袭、凋亡及对上皮间质转化作用的影响。方法：本研究以正常人胃粘膜上皮细胞（GES-1）和胃癌细胞（MGC-803、 BGC-823）为研究对象，miR-200b 为研究指标。首先提取正常未处理人正常胃 粘膜上皮细胞 GES-1 及胃癌 MGC-803、BGC-823 细胞总 RNA，逆转录之后进 行实时荧光定量 PCR（RT-PCR）法检测 miR-200b 在三种细胞中表达的差别， 而 miR-200b 启动子区甲基化水平通过亚硫酸氢钠修饰的 PCR（BSP）法进行检 测。其次，对 MGC-803、BGC-823 细胞进行不同浓度和不同时间点的去甲基化 处理，即使用浓度为 2.5、5.0、7.5、10μM 的 5 氮杂胞苷（5’-Aza-CdR）处理细 胞，每 24h 换液一次作用 72 小时后，用 RT-PCR 法检测 miR-200b 的表达量变化， BSP 法检测 miR-200b 启动子区甲基化水平的差异。根据表达量的差异及甲基化 的程度选择合适的药物处理浓度。最后，使用最合适的药物浓度（10μM）作用 MGC-803、BGC-823 细胞 72h， transwell 实验检测细胞侵袭能力，流式细胞计 术检测细胞周期及凋亡的情况。Western Blot 检测受 miR-200b 表达量差异影响 的上皮间质转化（EMT）相关指标的变化。结果：正常胃粘膜上皮细胞（GES-1）中 miR-200b 的表达量较高于胃癌细 胞 MGC-803、BGC-823，差异有统计学意义（P＜0.05）。而 miR-200b 启动子 区甲基化水平则与之相反， MGC-803、BGC-823 细胞系均较高于 GES-1，差异 有统计学意义(P＜0.05)。选用不同浓度 5’-Aza-CdR 药物处理细胞，两种胃癌细 胞系 miR-200b 的表达量有随着药物浓度逐渐升高的趋势，而浓度为 10μM 时 miR-200b 启动子区甲基化水平较空白对照组降低，差异有统计学意义（P＜0.05）。 Transwell 实验表明，处理组的胃癌细胞其侵袭能力较对照组明显减弱（P＜0.05）。 流式细胞术表明实验组较对照组细胞周期进展减慢，主要停留在 G1 期而 S 期细 胞数相对减少（P＜0.01）。与对照组相比实验组细胞晚期凋亡数量稍稍增多， 差异有统计学意义（P＜0.05）。Western Blot 实验表明，在表皮粘膜细胞中表达 量较高的 E-cadherin 实验组较对照组表达量升高，而在间质细胞中表达量较高的 N-cadherin,ZEB1,Slug,MMP9 实验组较对照组表达量降低，即实验组细胞上皮间 质转化（EMT）程度降低。I结论：MiR-200b 表达的下降可能在胃癌变过程中起到重要作用，其作用机制可能与 miR-200b 启动子区高度甲基化作用有关。miR-200b 启动子区存在发生 甲基化的位点并且甲基化程度的不同可以影响其表达量，而 miR-200b 表达量的 差异又与胃癌细胞 MGC-803、BGC-823 增殖、侵袭能力密切相关。所以抑癌基 因启动子区发生异常甲基化，在胃癌发生、发展及预后研究中有重要作用和深 远影响。关键词：甲基化作用 人正常胃粘膜上皮细胞 GES-1 胃肿瘤细胞 微 RNA-200b 上皮间质转化 细胞增殖 细胞侵袭IIAbstractObjective: Gene abnormal methylation plays an important role in a variety of disease mechanisms. This research aims at studying t