DNA的酶解课件.pptVIP

实验二 DNA的酶解 一、原理 所谓DNA酶解就是DNA被限制性内切酶切成大小不等的片段。可用于Southern分析或DNA体外重组等实验 限制性内切酶：共有三类，但只有第Ⅱ类识别位点和切点在相同部位，因而是实用的，这类内切酶通常识别DNA中4～6个核苷酸的顺序，识别的顺序为二重对称。酶解产生的DNA片段末尾可以是平齐末端(如Hae Ⅲ)或粘性末端（如EcoR I）。 限制性内切酶（restriction endonuclease) 应用:外源基因与载体的连接 （DNA连接酶） 酶单位定义：在最适温度，最适pH条件下，一小时完全水解1μgλ噬菌体DNA所需的酶量定为1个单位(u)。 二、方法 1．取0.1μg／μlλDNA溶液10μl于一干净的0.5ml Eppendorf管中。 2．加10×HindⅢ酶解缓冲液2μl，0.4u/μl HindⅢ 5μl，双蒸水3μl，使反应总体积20μl, 充分混匀。 3．在37℃水浴中保温2hr，保温结束后加2μl终止液，混匀。 4．电泳观察酶解结果。 酶解体系 三、注意事项 1．限制性内切酶较昂贵，且极易失活，要特别注意酶活力的保存，酶保存缓冲液一般有10mmol/LTris-HCl (pH7.4)，50～100mmol/L NaCl或KCl，lmmol/L DTT，100～200μg／ml BSA (保持蛋白浓度，使酶稳定)，50％甘油(存于-20℃不结冰，结冰反复解冻使酶失活) 2．限制性内切酶用量极少，必须严格注意吸样量的准确性及全部放入反应体系中 3．注意酶切时加样次序：水、缓冲液、DNA、最后才加酶 取液时，Tip要从溶液表面吸，以防Tip沾去过多酶，待用的内切酶要放在冰浴内，用后盖紧盖子，立即放回—20℃冰箱，防止限制性内切酶的失活 4．凡用在酶切反应中的一切塑料器皿，都要净水清洗，湿热灭菌，镊子夹取，不直接用手去拿，以防手上杂酶污染 * * 切割后产生平齐末端和粘性末端 识别的序列都具有回文结构 识别的 DNA序列多为4-6个碱基 是一类能识别和切割双链DNA分子 中特定碱基顺序的核酸水解酶 HpaI 5’GTTAAC 3’ 3’CAATTG 5’ 5’GTT AAC 3’ 3’CAA TTG 5’  e.g. Hind I Hind II Hind III  (流感嗜血杆菌中三个酶 Haemophilus influenzaed)※第一个字母（大写、斜体） 该酶的微生物属名※第二、三个字母（小写、斜体） 代表微生物种名※第四个字母（斜体） 代表寄主菌的株或型※用罗马数码I、II、III等区分同一株具  有不同特异性的酶 命名: 人工接头连接 同聚物加尾连接 平端连接 同一限制性内切酶位点连接 不同限制性内切酶位点连接 粘性末端连接 （1）互补粘端DNA或切口间的连接  5’ ACGOH pAATTCGT 3’ 3’ TGCTTAAp HOGCA 5’ ATP、Mg2+ T4连接酶  5’ ACGAATTCGT 3’ 3’ TGCTTAAGCA 5’ 反应例解： （2）平端连接5’ C G AOH pC G T A 3’3’ G C Tp OHG C A T 5’  ATP、Mg2+ T4连接酶 5’ CGACGTA 3’ 3’ GCTGCAT 5’ 2μl 充分混匀，37℃水浴中保温1hr 3μl 5μl 2μl 10μl 体积 终止液 (EDTA/甘油/溴酚兰) 补足体积，达到一定浓度 双蒸水 限制性内切酶 0.4u/μl HindⅢ 维持pH值，离子强度 10×HindⅢ酶解缓冲液 λ噬菌体DNA 0.1μg／μl λDNA 作用 加入物质 *