hbv相关抗原hlaa3超型ctl表位肽预测与鉴定-prediction and identification of hbv related antigen hlaa 3 supertype ctl epitope peptide.docxVIP

HBV 相关抗原 HLA-A3 超型 CTL 表位的预测与鉴定摘要研究背景：由乙型肝炎病毒（HBV）引起的慢性乙型肝炎是我国常见的慢性传染 病之一，严重危害人民健康。以往研究表明，抗原特异性的 CD8+细胞毒性 T 淋巴细 胞（cytotoxic T lymphocyte，CTL）对体内 HBV 的清除起关键作用。在乙肝患者体内， 来源于 HBV 相关抗原的、MHC-I 类分子限制性表位肽被认为是特异性 CD8+CTL 识别 病毒感染细胞的靶标。虽然慢性 HBV 感染患者外周血中存在抗原肽特异性 CTL，但 这种病毒特异性 CD8+CTL 的频率及功能减低，是 HBV 得以持续存在的一个重要原因。 因此，通过主动免疫方式增强 HBV 相关抗原肽特异性 CTL 反应，是治疗慢性 HBV 感染的理想策略。既往对于病毒抗原表位肽的研究多针对单一主要组织相容性复合体（Major histocompatibility complex, MHC）限制性，缺乏覆盖更多人白细胞抗原（human leucocyte antigen ，HLA）背景人群的治疗性表位肽疫苗。HLA 分子的高度多态性与 T 细胞识别的 MHC 限制性是研制广谱高效表位肽疫苗的最大障碍。HLA 超型是指具 有相同的肽结合特异性的不同 HLA 分子的总合。这一概念的提出，为基于 HBV 相关 抗原超型表位肽疫苗的设计提供了新的思路。研究目的：本研究初步分析了慢性 HBV 感染与 HLA-A 超型的相关性，预测并初 步鉴定了 HLA-A3 超型限制性 HBV 相关抗原特异性 CTL 表位肽，为基于超型表位的 慢性 HBV 感染的治疗提供实验基础及新的候选靶标。研究方法：分别从西南医院肝炎门诊和献血中心收集慢性 HBV 感染者及健康志愿者外周血，通过聚合酶链反应/序列特异性引物技术（PCR-SSP）对其 HLA 型别进 行检测，分析慢性 HBV 感染与 HLA-A 超型之间的关系。基于 SYFPEITHI、BIMAS、 SVMHV、IEDB、EPIJEN、NETMHC 6 个表位预测网站，分别预测出 HLA-A3 超型各 等位基因（HLA-A*0301、HLA-A*1101、HLA-A*3101、HLA-A*3301、HLA-A*6801）限制性表位，并对预测结果进行整合，预测出与 HLA-A3 超型各等位基因具有高亲和 力的乙肝表面抗原（HBsAg）和乙肝核心抗原（HBcAg）候选表位肽。鉴于 HLA 超 型分子具有结合相同或相似表位肽的特点，并且在 HLA-A3 超型中，HLA-A*1101 分 子表型频率最高，因此，我们选择首先鉴定候选超型表位肽 HLA-A*1101 限制性。在体外细胞功能试验中，通过 Elispot Assay 检测候选表位肽诱导外周血单核细胞 （PBMC）IFN-γ的分泌；胞内因子染色流式细胞术分析表位肽特异性 CD8+CTL IFN- γ及 GranB 的分泌；CFSE 标记检测表位肽诱导的特异性 CD8+CTL 的增殖；Pentamer 染色流式细胞术分析法检测 HLA-A*1101 健康志愿者 PBMC 经肽诱导后所产生的特异 性 CD8+CTL 频率，以及慢性 HBV 感染患者外周血表位肽特异性 CD8+CTL 的频率。 最后通过 Elispot assay 初步鉴定候选表位肽对其他 HLA-A3 超型等位基因的健康人 PBMC 所产生的诱导效应。研究结果：在我们收集的 44 例来自西南医院献血中心的健康志愿者中，HLA-A3超型为主要 HLA-I 类分子超型基因，其中以 HLA-A*1101 频率最高，在 49 例慢性 HBV 感染者中，HLA-A2 超型为最高频超型等位基因。结合多个在线表位预测网站，采用 整合法预测的超型表位兼顾了与 HLA-A3 超型全部等位基因具有高亲和力的表位（P5, P6, P7, P8, P9）。根据应答指数以及胞内因子染色结果证实五条候选表位肽均能在体 外诱导 HLA-A*1101 健康人外周血表位肽特异性 CD8+CTL 增殖并分泌 IFN-γ和 GranB。在 HLA-A*1101 阳性的慢性 HBV 感染患者中，P7 肽诱导产生的特异性 CD8+CTL 频率明显高于已知的阳性表位 P6 肽。五条候选超型表位肽均可以诱导带有 HLA-A3 超型等位基因个体的 PBMC 分泌 IFN-γ,但是对同属于 HLA-A3 超型的不同 HLA 等位基因，其限制性 CTL 分泌 IFN-γ的能力存在差异。研究结论：结合本研究中各部分的实验结果，HLA-A3 超型在人群中分布频率最高，同时，HLA-A*1101 是 HLA-A3 超型中最高频等位基因。利用整合法预测的 5 条 HBV 相关抗原候选表位，经初步鉴定