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hbx基因转染sudhl4细胞对其生长侵袭的影响-effects of hbx gene transfection on the growth and invasion of su dhl 4 cells

原创性声明本人郑重声明:所呈交的学位论文,是本人在导师的指导下,独立进行研 究所取得的成果。除文中已经注明引用的内容外,本论文不包含任何其他个人 或集体已经发表或撰写过的科研成果。对本文的研究作出重要贡献的个人和集 体,均已在文中以明确方式标明。本声明的法律责任由本人承担。学位论文作者:日期:年月日学位论文使用授权声明本人在导师指导下完成的论文及相关的职务作品,知识产权归属郑州大学。 根据郑州大学有关保留、使用学位论文的规定,同意学校保留或向国家有关部 门或机构送交论文的复印件和电子版,允许论文被查阅和借阅;本人授权郑州 大学可以将本学位论文的全部或部分编入有关数据库进行检索,可以采用影印、 缩印或者其他复制手段保存论文和汇编本学位论文。本人离校后发表、使用学 位论文或与该学位论文直接相关的学术论文或成果时,第一署名单位仍然为郑 州大学。保密论文在解密后应遵守此规定。学位论文作者:日期:年月HBx 基因转染 SUDHL-4 细胞株对其生长侵袭的影响研究生 彭邦安 导 师 张 艳郑州大学药学院药理学教研室 河南 郑州 450052中文摘要背景和目的:恶性淋巴瘤(malignant lymphoma,ML)是淋巴造血系统的肿瘤,按照病理类 型分为霍奇金淋巴瘤(Hodgkin disease, HL)和非霍奇金淋巴瘤(non-Hodgkin lymphoma, NHL)。在中国,每年新发恶性肿瘤中淋巴瘤约占 4%,是九种常见肿 瘤中的一种,其在肿瘤导致的死亡排名中居列第十位,其中又以非霍奇金淋巴 瘤为主,占 ML 的 85%~90%。弥漫性大 B 细胞淋巴瘤(Diffuse large B-cell lymphoma,DLBCL )在组织学形态、遗传学特征、免疫表型及临床表现上都 存在着高度的异质性,是 NHL 中最为常见的一类组织学亚型。临床上发现许多 恶性淋巴瘤患者伴有乙型肝炎病毒的感染,两者的关系日益受到相关研究人员 的关注。大量临床的研究数据也进一步表明 NHL 患者乙型肝炎病毒(HBV)感 染率明显高于普通人群及其他相关性实体肿瘤的患者,恶性淋巴瘤合并 HBV 的 感染率仅次于肝癌;同时 HBV 的再激活在 NHL 合并 HBV 感染患者的治疗中表 现显著,这些研究和发现充分表明 HBV 病毒感染与淋巴瘤的发生发展存在着一 定的相关性。乙型肝炎病毒(HBV)具有 S、C、P 以及 X 区 4 个重叠开放读码框架(ORF), HBV 的 X 基因作为其中最小的 ORF,能够编码 145 个氨基酸组成的蛋白,即 HBx。HBx 可通过多种不同的作用诱导肝细胞癌(HCC)的形成,并促其发展, 其中抑制肝细胞发生凋亡在 HBV 导致 HCC 发生的过程中起到巨大的作用。 然而,目前的研究和相关报道尚不能解释 HBV 感染在 NHL 的发生和进展中的 作用及具体机制。因此本实验选用人弥漫性大 B 细胞淋巴瘤(DLBCL)细胞株 SUDHL-4 作为研究对象,采用脂质体转染的方法,将 HBx 基因转入 SUDHL-4I细胞株中,建立带有乙肝病毒的淋巴瘤细胞模型,研究 HBx 对 B-NHL 细胞生长侵袭转移的影响并探讨其可能的作用机制,为筛选有效的治疗药物开辟新的途 径,为淋巴瘤合并 HBV 感染的治疗提供更多有力的理论依据。方法:1、 利用分子克隆的方法构建 HBx 基因的真核载体 pcDNA3.1-X。2、 将 pcDNA3.1-X 通过脂质体瞬时转染转入 B-NHL 细胞 SUDHL-4 中, 构建整合有 HBV X 基因的淋巴瘤细胞株 SUDHL-4-HBx,以 SUDHL-4 及转染 空载体的 B-NHL 细胞 SUDHL-4-con 作对照,利用 CCK-8 法检测转染 96h 内各 组细胞的增殖情况,应用流式细胞仪检测细胞周期和凋亡情况。3、将 pcDNA3.1-X 通过脂质体转染法转入 SUDHL-4 后,用 G418 筛选稳 定转染 HBx 的 SUDHL-4 细胞株,取对数期 SUDHL-4、SUDHL-4-con 和稳定转 染的 SUDHL-4-HBx 细胞,利用 CCK8 法检测三种细胞 96h 的生长情况;以 SUDHL-4 及转染空载体的 B-NHL 细胞 SUDHL-4-con 作对照,应用流式细胞仪 检测细胞周期和凋亡情况,用改良噻唑蓝法(MTT)检测细胞粘附力;用 Transwell 小室实验检测细胞迁移和侵袭能力。结果:1、重组质粒双酶切结果及质粒测序结果表明成功构建pcDNA3.1-X。2、瞬时转染后SUDHL-4细胞有HBx mRNA的表达,与SUDHL-4组细胞及 SUDHL-4-con组细胞相比,SUDHL-4-HBx细胞的增殖减缓,G0/G1期细胞比例 增加、S期细胞所占比例减少,细胞凋

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