hbx基因对肝细胞hl7702细胞色素c氧化酶亚基iii表达及细胞色素c氧化酶活性的影响-effects of hbx gene on expression of cytochrome c oxidase subunit iii and cytochrome c oxidase activity in hepatocyte hl 7702.docxVIP

前言乙型肝炎病毒（Hepatitis B virus, HBV）慢性感染是导致肝细胞癌（Hepat- ocellular carcinoma, HCC)发生的主要危险因素，流行病学调查显示，全球慢 性 HBV 感染者超过 3 亿 5 千万人，其中 75%分布在亚太地区。每年有超过一百万 人死于 HBV 相关性疾病，但 HBV 的具体致病机制尚未完全阐明。HBV 基因组有 4 个开放读码框，分别为 S、C、P、X，其中 X 基因是 HBV 基因 组最小的开放读码框，编码基因区位于 1374-1838 核苷酸之间，全长转录体编码 的 X 蛋白（Hepatitis B virus X protein, HBx）由 154 个氨基酸组成，分子量 约为 16.5 kDa。X 基因结构的特殊性和高度保守性，提示其在 HBV 的生物学上具有重要的功 能和意义，HBx 在细胞内主要定位于细胞质中，少部分位于细胞核内，进一步研 究则发现胞质中的 HBx 主要分布于线粒体外膜上[1]，线粒体是细胞内进行电子传 递及氧化磷酸化等重要生理功能的细胞器。此外，线粒体还参与细胞的凋亡信号 转导，被认为是细胞凋亡的枢纽环节[2]。本实验观察的细胞色素 C 氧化酶即是线 粒体中参与电子传递及氧化磷酸化的重要蛋白质。而细胞色素 C 氧化酶亚基Ⅲ（COⅢ）是组成细胞色素 C 氧化酶的重要亚基。目前已证实 HBx 并不直接作用于双链 DNA，而主要通过和细胞内多种蛋白质 的相互作用来影响细胞的生物学功能[3]，故研究体内 X 结合蛋白对阐明 HBx 的作 用及机制有重要意义。我们前期研究已经通过酵母双杂交体系从成人正常肝细胞 cDNA 文库中筛选出一种新的 X 结合蛋白--细胞色素 C 氧化酶亚基Ⅲ（COⅢ）， 并在离体结合试验及免疫共沉淀试验中验证了两者的特异性结合[4]。本实验进一 步研究体外培养的细胞中，X 基因对 COⅢ及细胞色素 C 氧化酶活性的影响。第一部分HBx 基因转染成人肝细胞株 HL-7702 并对 X 基因的表达进行 RNA 干扰 一 实验设计本部分实验用脂质体转染的方法分别将重组 HBV X 基因真核表达载体 pcDNA3－X 和空质粒 pcDNA3 导入成人肝细胞 HL7702 中，建立表达 HBV X 基因的真核细 胞模型和对照组细胞模型，运用 RT-PCR 和 Western blot 鉴定 HBV X 基因在肝细 胞内是否成功表达，再对 HBx 基因进行 RNA 干扰，RNA 干扰后再次运用 RT-PCR 和 Western blot 鉴定 HBV X 基因在肝细胞内的表达情况，据此了解 RNA 干扰的 效果。脂质体转染法是一种真核细胞表达载体转染方法，是利用人工脂质双层包裹 大分子生物或药物，通过脂质双层与细胞膜的相互作用，将内容物输送入细胞中。 脂质体转染法可保护生物大分子不受细胞内相应酶的降解，对细胞损伤小，近年 来被广泛应用在分子生物学实验中。RNA 干扰（RNAi）是指由特定双链 RNA（double stranded RNA, dsRNA）引 发同源信使 RNA（mRNA）降解的转录后基因静默机制。这类特定 dsRNA 经酶切后 会形成很多 21-23nt 双链小分子片段，称为 siRNA, siRNA 一旦与 mRNA 中的同源 序列互补结合，则可以激活内源性 RNA 内切酶，从而特异性降解目的 mRNA，达 到高特异性的基因沉默作用[5]。本实验以上文所述已构建好的 HL7702/HBx 细胞 表达的全长 X 基因为靶序列，根据 Reynolds[6]等总结的 siRNA 设计原则设计出 siRNA 序列，对 X 基因的表达进行 RNA 干扰，再运用 RT-PCR 和 Western blot 鉴 定 HBV X 基因在肝细胞内的表达，并与 RNA 干扰前的数据对比，观察 RNA 干扰的 效果。二 实验材料和实验仪器1 主要实验试剂RNA 抽提试剂盒购自深圳生物晶美公司pcDNA3 表达载体购自 Invitrogen 公司 重组 HBx 基因真核表达载体 pcDNA3－X由福建省消化研究所制备 成人肝细胞株 HL-7702购自中科院上海细胞库DMEM 培养基/F12 细胞培养液购自美国 Invitrogen 公司小牛血清购自美国 Bibco 公司胰蛋白酶购自 Invitrogen 公司TransfastTM 转染试剂盒购自美国 Promega 公司MMLV 反转录试剂盒购自美国 Promega 公司PCR 试剂盒购自美国 Promega 公司TRIZOL 试剂购自美国 Invitrogen 公司Taq DNA 聚合酶购自美国 Promega 公司逆转录试剂盒购自美国 Promega 公司小鼠抗人 HBx 单克隆抗体购