小白菜和菜薹细胞质雄性不育类型分子鉴定.docVIP

小白菜和菜薹细胞质雄性不育类型分子鉴定 　　摘 要：通过检索NCBI核苷酸数据库获得orf 138 和orf 224 开放阅读框序列，依据其保守序列设计2 对引物，对几种来源不同的小白菜和菜薹细胞质不育系及其保持系进行PCR 扩增。orf 138 引物在小白菜和菜薹细胞质雄性不育系中均扩增出573 bp 的片段，orf 224引物只在一个菜薹雄性不育系中扩增出653 bp 的片段。同源性比对发现orf 138引物在雄性不育系中扩增的片断与orf 138 基因同源度达100%，表明这几个雄性不育系类型分别为萝卜细胞质不育类型；orf 224引物在雄性不育系中扩增的片断与orf 224基因同源度达100%，表明这一雄性不育系类型为甘蓝型油菜不育类型。 　　关键词：小白菜；菜薹；细胞质雄性不育 　　 在十字花科作物的优势育种中，除利用自交不亲和系以外，利用雄性不育系也是一条重要的途径。利用雄性不育可以省去人工去雄过程，因此在农作物杂种优势利用上有重要应用价值。细胞质雄性不育（CMS）是由线粒体基因组的重排引起的，CMS 相关基因产生一种新的蛋白质，直接或间接破坏线粒体正常的生理功能，从而导致花粉败育[1]。在芸薹属作物中已鉴定和分离出一些与CMS 有关的线粒体基因，如Ogu 型萝卜的orf 138[2]、Pol 型甘蓝型油菜的orf 224、Nap 型甘蓝型油菜的orf 222[3]以及叶用芥菜的orf 220[4]等，而研究最多、利用最广泛的是Ogu CMS和Pol CMS[5]。 　　 试验利用油菜线粒体CMS基因特异性引物及基于重复序列的PCR引物对几种来源不同的小白菜和菜薹细胞质雄性不育材料和保持系材料进行分析和鉴定，以建立有效的小白菜和菜薹细胞质雄性不育的分子鉴定方法，为杂交品种的选育提供参考。 　　1 材料与方法 　　1.1 试验材料 　　 小白菜不育系材料8份，保持系材料3份；菜薹不育系材料2份，保持系材料1份，具体见表1。 　　1.2 试验方法 　　 ①基因组的提取和引物设计 基因组DNA的提取参照CTAB法[6]。根据油菜线粒体中的orf 138 和orf 224 开放阅读框保守区序列设计2对引物，引物交由金瑞斯生物科技公司合成，引物序列见表2。 　　 ②PCR 扩增 PCR扩增反应在PX2 ThermalCycler（Thermo Hybaid）PCR仪上进行，反应体系为：DNA模板6 ng，10×buffer 2.5 μL（含MgCl2）， 　　1.5 mmol/L dNTP， 0.4 U Tag DNA聚合酶（MBI）， 　　0.6 μL引物（25 pmol/μL），加水至25 μL。PCR扩增反应程序为：94℃ 30 s，50℃ 45 s，72℃ 2 min，共35个循环，最后一个循环结束后再在72℃继续延伸10 min于4℃保存。PCR产物在1.5%琼脂糖（西班牙产）凝胶上电泳分离（5 V/cm），电泳结束后在紫外灯下观察照相。 　　 ③PCR特异条带的连接转化克隆和测序 连接体系为5 μL，0.5 μL pGEM-T载体，0.5 μL Ligase，2.5 μL 2×Ligase，1.5 μL PCR产物，然后16℃连接过夜，再转化TOP10 感受态细胞，进行菌液PCR，利用菌液PCR测序分析。 　　 ④序列分析 将特异DNA 片段的核苷酸序列在NCBI 网上应用BLAST 命令（http://www.ncbi. nlm.nih.Gov/blast）进行氨基酸序列同源性比对。 　　2 结果与分析 　　2.1 orf 138 和orf 224 引物的扩增结果 　　 用设计的orf 138 引物和orf 224引物对12份小白菜和3份菜薹材料的DNA进行扩增。用orf 138 设计的引物在不同材料间进行PCR 扩增，扩增结果表明不同材料间存在差异，在小白菜材料紫红A、WS-1、WS-2、WS-3、WSX-4、WSX-5、苏A07A、奶A和菜薹HA1不育系中扩增出600 bp左右的条带，大小相同（图1a）；而保持系材料间均没有扩增出条带。用orf 224特异引物进行不同材料的PCR扩增，只在红菜薹材料HA1中扩增出650 bp左右的条带，其他不育材料及保持系材料间均没有扩增出差异条带（图1b）。 　　2.2 测序和同源性比较 　　 分别选取在orf 138 引物和orf 224引物扩增出条带的供试材料阳性克隆进行测序。利用NCBI在线Blast功能对测序结果进行分析，结果表明利用orf 138 的保守序列设计的引物扩增出的片段的核苷酸序列一致性达到100%，长度均为573 bp，该片段与Ogu 型胞质不育萝卜线粒体开放读码框orf 138 同源性为100%（图2），说明